肾脏病学中尿液流式细胞检查的实用指南

第二节　尿液流式细胞检查

为了解脱显微镜检查的繁琐，包括美国在内的一些国家着手研制开发一种能代替显微镜的自动分析仪，但终因尿中的成分复杂，不能有效鉴别而未能成功。1995年日本Sysmex公司研制出Sysmex UF-100全自动尿液细胞分析仪。它是集电子技术、激光技术、计算机技术、流体理论于一体，是一种在功能水平上对单细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术，被誉为实验室的“CT”。目前，干化学分析与尿液流式细胞分析交叉确认，即隐血与红细胞、白细胞酯酶与白细胞、蛋白与管型、亚硝酸盐与细菌。

尿流式细胞的检测主要解决以下几个问题。①鉴别血尿来源：能提供红细胞计数及红细胞相关信息，如RBC-P70Fsc、RBC-Fsc-DW等，但它是以红细胞的大小为切入点而非形态；②判断尿路感染及其疗效监测：能提供WBC计数、细菌计数及WBC-Fsc散点图，可以判断是否存在尿路感染，同时也可用于尿路感染的疗效监测。随着样本存放时间的延长，细菌数增高，WBC-Fsc因WBC体积的改变而降低，而WBC数在一定时间内仍可保持稳定；③对尿崩症等疾病的疗效监测：尿液流式细胞分析仪可检测尿液的导电率，用于评价尿渗透压，对尿崩症等疾病的诊断及疗效监测有一定意义。

一、分析原理

光线通过不均匀的媒质（媒质中存在其它物质颗粒或媒质本身密度不均，如尿液）时，部分光束偏离原来方向而分散传播，从侧向也可以看到光的现象，称为散射。现就日本东亚医疗电子有限公司的UF-100（注：100代表仪器每小时分析的标本数）型尿液自动分析仪的原理做一简述：吸取尿液0．8ml，经4倍稀释后，先进行两种荧光染色，一种为菲啶，主要染细胞核，用于区别有核和无核细胞或成分（如红细胞与白细胞、病理管型与透明管型）；另一种为羧化氰，主要染细胞各个膜（细胞膜、核膜），用于区别细胞的大小（如上皮细胞与白细胞）。染色的标本随着液压的作用，从样品喷嘴进入鞘液流动室，在无粒子的鞘液包绕下，尿中的细胞成单个排列通过流动池。在这里受到氩激光的照射，并产生相应的三种信号，前向散射光、荧光、电阻抗。前向散射光又分为前向散射光强度（Fsc）和前向散射光脉冲宽度（Fscw），前者反映细胞的大小，后者反映细胞的长度。荧光信号也分为荧光强度（Fl）和荧光脉冲宽度（Flw），前者反映细胞染色质的强度，后者反映细胞染色质的宽度。电阻抗主要用于反映细胞的体积和尿液的导电率。仪器通过对上述各种信号进行综合分析，判断出每个有形成分的名称，并给出一系列有关数量、大小等参数，同时绘制出散射图和直方图（见图2-8）。

图2-8　UT-100全自动尿分析仪工作原理图

二、红细胞参数的临床意义

红细胞直径约8μm，无核，因此，其荧光强度（Fl）很低，在红细胞分析中意义不大，但可与其他有形成分区别，又因体积相对较小，故前向散射光强度（Fsc）也偏小。主要红细胞形态信息（RBC-info）如下。

（一）红细胞前向散射光强度（RBC-Fsc）

反映红细胞大小的指标。据此，可以判断肾小球性血尿还是非肾小球性血尿。它主要是以红细胞大小为指标。根据Hyodo的标准：≥80%的红细胞Fsc＜84ch为肾小球性血尿（dysmorphic或microcytic）；≥80%的红细胞Fsc＞126ch为非肾小球性血尿（isomorphic或normocytic）；介于两者之间的为混合性血尿（mixed）。Ch（Channel），通道，是厂家对收集到的光学信号进行衡量的一个单位，表示脉冲信号的强度。

（二）红细胞70%前向散射光强度（RBC-P70Fsc）

红细胞70%（从Fsc小值方算起）前向散射光强度，意义与RBC-Fsc基本相同。也是反映红细胞的大小，是鉴别肾小球性和非肾小球性血尿的最关键、最重要参数（见表2-15）。

表2-15　RBC-P70Fsc与相差显微镜RBC形态相关分析

摘自：中国医师杂志2006，8（9）：1182

（三）红细胞前向散射光强度分布宽度（RBC-Fsc-DW）

反映红细胞大小不等程度的指标。此数值增高提示红细胞体积分散度较大，红细胞大小不等，其数值越大，红细胞大小不等的程度越高。理论上讲，混合性血尿最大，非肾小球性血尿最小，肾小球性血尿介于中间（见表2-16）。

表2-16　RBC-Fsc-DW与相差显微镜RBC形态相关分析

摘自：中国医师杂志2006，8（9）：1182

也有作者将红细胞的Fsc和Fsc-DW联合作为评价红细胞来源的指标，前者反映红细胞的大小，可用70%或80%（只影响到特异性和敏感性）的红细胞Fsc，其值越小，代表红细胞直径越小，反之越大；后者是反映红细胞的大小分散程度（即大小不等的程度），其值越大，分散度越大，反之越小（见图2-9）。

标准：microcytic：RBC-P70Fsc＜80ch RBC-Fsc-DW＞或＜50ch

　　　nonmocytic：RBC-P70Fsc＞100ch RBC-Fsc-DW＜50ch　

　　　mixed：RBC-P70Fsc＞100ch RBC-Fsc-DW＞50ch　　　　

或RBC-P70Fsc80～100ch RBC-Fsc-DW＞或＜50ch

图2-9　RBC-info、RBC-P70Fsc、RBC-Fsc-DW之间的关系

（四）红细胞前向散射光强度直方图

肾小球性血尿，表现为曲线不规则或两侧不对称，峰为驼背样或波浪样，峰值＜100ch，多在70ch左右，曲线基底部（红细胞散点宽度）宽，说明红细胞大小不一。而非肾小球性血尿，表现为两侧对称，高尖、规则，曲线多为单峰，峰值＞100ch，多在110ch左右，基底部相对较窄，说明红细胞大小相对集中。混合性血尿，两侧不对称，峰为锯齿状，峰值跨度大，常在40～120ch，基底部更宽。说明红细胞大小高度不一（见图2-10、表2-17）。

图2-10　三种血尿的直方图

说明：A非肾小球性血尿　B混合性血尿　C肾小球性血尿

表2-17　肾小球性血尿与非肾小球性血尿参数比较（-x±s）

摘自：中国误诊学杂志，2005，11：2117

用这些指标来鉴定血尿来源，主要依据是红细胞的大小，而非形态。有报道，用前向散射光的强度来鉴别血尿来源，受干扰物影响的主要是非均一性红细胞，假阳性占16．5%～26．8%，其中80%由结晶（主要是尿酸结晶和草酸钙结晶）和细菌引起，8%由霉菌引起，其余由精子、变形白细胞和脂肪滴引起，如果在假阳性中提示的是microcytic，则多为草酸钙引起，如果提示的是non-classified，则多为酵母菌类引起。假阴性占14%。总之，提示肾小球性血尿时，尤其是数量较少的情况下，要高度除外尿中杂质所致，所以，在此情况下，一定要做尿的红细胞形态检查（见表2-18）。

表2-18　UF-100分析仪法检测尿标本假阳性结果影响因素

摘自：临床检验杂志2004，22（1）：67

二、白细胞参数的临床意义

因为尿中白细胞的直径为10μm，不但比红细胞略大，而且还有细胞核，因此，WBC-Fsc、WBC-Fl都会比RBC-Fsc、RBC-Fl强，尤其是荧光强度，借此可以把两者区分。白细胞出现在散射图的中央。有人按细胞出现在散射图上的位置不同，把白细胞分为高活性区（白细胞仅在高活性区出现）、中区（白细胞在高活性区和低活性区之间出现）、两区（白细胞在高活性区和低活性区同时出现）和低活性区（白细胞仅在低活性区出现）（见图2-11、图2-12）。分析白细胞除数量外，其它参数主要是WBC-Fsc、WBC-Fl，白细胞和红

图2-11　白细胞分布散射图

注：A高活性区　B中区　C两区　D低活性区

图2-12　白细胞Fsc直方图　左为高活性，右为低活性

细胞一样，也有很多的形状，当白细胞存活时，白细胞表现为WBC-Fsc强和WBC-FI弱，而当白细胞受损害或死亡时，会出现WBC-Fsc弱和WBC-FI强的改变。白细胞检测的主要的意义是：

（一）鉴别存活/死亡的白细胞

存活（高活性）的白细胞体积和细胞内的颗粒密度均一，分布在Fsc强、Fl弱的区域，而破坏或死亡（低活性）的白细胞，体积和颗粒密度都有较大的变化，分布在Fsc弱、Fl强的区域。(www.chuimin.cn)

（二）区别急性/慢性感染

急性尿路感染，尿白细胞＞60/μl，而且白细胞信息提示为高活性的白细胞，且WBC-Fsc强和WBC-FI弱；慢性感染，尿白细胞＞10/μl，白细胞信息提示为低活性的白细胞，且WBC-Fsc弱和WBC-FI强。

（三）提示感染转归

尿感患者，在急性感染初期，白细胞位于散射图右上方（高活性），经治疗后逐渐下移到右下方（低活性），此改变比白细胞数下降要早，因此，可以提示感染的早期转归。

（四）鉴别白带污染

女性患有阴道炎症时，会有大量的白细胞，有时会混入尿中，此时患者无尿路感染的症状，同时可能会伴有大量的扁平上皮细胞，白细胞常为低活性。

因为尿中的白细胞大小、形态、结构变化比较大，有部分白细胞与小圆上皮细胞重叠，所以小圆上皮细胞最容易干扰白细胞的测定，此外，酵母菌、管型碎片、电导度过低时，也会干扰结果，此时应做显微镜检查。

三、电导率测定的意义

尿的电导率（Condductivity）代表尿液中粒子的电荷，与质点的种类和大小无关，与渗透压有密切关系。其结果与性别无关，因为糖尿、蛋白尿、血尿均不影响该指标，故也不能做为它们的诊断指标。因此，测定尿液电导率对了解肾脏稀释浓缩功能有重要意义（见表2-19）。

表2-19　尿比重、尿渗量、尿电导率的意义

尿液电导率的测定，其原理是采用电极法，操作过程是样品进入流动池之前，在样品两侧各有一个电极传导性感受器，它接收尿液样品中的电导率电信号，并将电信号放大直接送到微处理器，通过处理将结果计算出来。该仪电导率的单位为mS/cm，表示长度为1cm尿液标本有多少个毫西门子的电阻。

尽管尿的电导率与尿的渗量存在一定的差异，但临床上仍通过一定的换算关系，用尿的电导率代替尿的渗量。正常人的电导率为：8．1～39．7mS/cm。据江明华等报道，电导率与尿渗量之间的关系为y＝23．5x＋119．9，r＝0．92具有很好的相关性，并且与尿液其他电解质呈正相关，能够完全区分正常肾浓缩功能与肾浓缩功能障碍的病例。

（一）间接反映尿渗量

尿渗量比尿比重更能反映肾脏的浓缩功能，是反映肾脏髓质功能的重要指征（见表2-20）。

表2-20　正常及各种疾病随机尿液电导率测定结果

整理：丛玉隆等．临床检验杂志2007，25（1）：63

（二）对糖尿病和尿崩症进行鉴别诊断

尿崩症患者抗利尿激素严重分泌缺乏或部分缺乏、习惯性多饮引起尿液电导率偏低。

（三）对电导率的监控，可以预防某些结石的发生。

四、其他有形成分测定的意义

（一）上皮细胞（EC）

上皮细胞的种类多，大小不等，比白细胞大，散射光程度强，又因都含有细胞核和线粒体，故荧光程度也强。虽然测定结果会给出上皮细胞的参数，甚至小圆上皮细胞（SRC）的定量，但毕竟该仪器不能明确区分各类上皮细胞，所以，当结果提示较多的上皮细胞时，应该离心（染色）镜检。

（二）管型（CAST）

因为管型种类多，形态各异，故出现在散射图上的位置也不一样。透明管型体积大、但无内容物，有极高的前向散射光强度分布宽度和微弱的荧光分布宽度，出现在第2个散射图的中、下区域，而病理管型，除了体积大外，管内充有不同的内容物，如颗粒、细胞等，所以，同样有有极高的前向散射光强度分布宽度和强的荧光分布宽度，出现在第2个散射图的中、上区域。该仪器借助这两个参数，只能把管型区分为透明管型和病理管型，至于是哪一种管型，只有依靠显微镜检查来明确。

（三）细菌（BACT）

由于细菌体积小，故前向散射光很弱，但因含有DNA和RNA，所以荧光强度要比红细胞强，比白细胞弱，分布在第1个散射图的红、白细胞之间的下面。但仍不能对细菌进行鉴定，需要尿培养。以细菌数≥6000/μl为阳性结果的判定标准，特异性92．4%，敏感性63．8%，假阳性率7．6%，假阴性率36．2%。认为此域值为诊断泌尿系感染的最佳临界点（见表2-21）。

表2-21　不同阳性标准与培养法结果比较（%）

说明：本表是以细菌培养＞10CRU/ml做为阳性标准来计算的。其中1指UF-100的细菌计数≥6000/μl为阳性域值；2指UF-100的细菌计数≥1000/μl为阳性域值；3指选择出的标本数满足UF-100或者是干化学的阳性标准；4指选择出的标本须同时满足UF-100及干化学的阳性标准

（四）结晶（X′TAL）

结晶出现在散射图的红细胞区域，由于结晶的多样性，其散射光强度分布很宽，如草酸盐的分布接近Fsc轴，而尿酸盐的分布与红细胞在一起（可对红细胞产生干扰），如果提示结晶，应该离心镜检。草酸钙结晶是尿中最常见的有形结晶之一，在酸性尿液中形态有哑铃形、球形及折光性强的八面体，有时也在中性或碱性尿中出现，不溶于乙酸。流式细胞仪通过在稀释液中加入螯合剂和35℃加温处理，虽然消除了尿液标本中的无定形结晶（磷酸盐、尿酸盐等），但草酸钙结晶却不能被去除。当出现以下情况时要客观分析：①当标本中仅有红细胞时，基本不会出现红细胞与草酸钙结晶间的误认；②当尿液中仅有草酸钙结晶时，则会出现误认草酸钙结晶为红细胞，使RBC计数值错误。其原因有：草酸钙结晶的形态大小与红细胞类似，对全自动尿沉渣分析仪测定红细胞有一定的影响，易将草酸钙结晶误认为RBC。因此，在报告中如果结晶尿RBC＞15/μl，隐血阴性则需要在显微镜下进行鉴别，草酸钙结晶形态不规则、折光性强，易与RBC区分（见表2-22）。

表2-22　红细胞和草酸钙结晶实测值与预期值间的相关性

摘自：临床检验杂志2002，20（4）：4

（五）酵母细胞（YLC）和精子细胞（SPERM）

两者都含有DNA和RNA，故荧光强度很高，而散射光强度与红、白细胞接近，所以它们的散射图分布在红、白细胞之间的区域，但由于酵母细胞的Fscw小于精子细胞，根据Fscw可以把两者区分开来。如果提示出现，应该离心镜检。

五、尿全自动分析的报告及意义

包括12项结果，其中定量5项，定性5项，附加2项。由于与尿化学分析仪配合使用，并相互确认，故报告中也附带有干化学分析结果。报告为彩色打印，是因为在散射图中，不同的颜色代表不同的有形物质（见表2-23）。虽然报告中的有形成分分为xx/μl和xx/Hp两种单位形式，但并非是真正意义的显微镜下结果，而是换算得出的，如高倍视野相当于0．18μl（即每高倍视野数＝xx/μl×0．18μl），低倍视野相当于0．29μl（即每低倍视野数＝xx/μl×0．29μl）。在日常的应用中因为尿流式细胞仪与尿沉渣显微镜计数的原理不同，因此两者的参考范围存在较大差别，而且各家的报道也有一些出入。据丛玉隆报道：流式细胞仪红细胞的参考值：男性是0～10/μl，女性是0～24/μl；镜检法：男性是0～4/μl，女性是0～9/μl。由此可知，流式细胞仪测定法明显高于定量板镜检法。其中的主要原因有：①仪器的误认：结晶、酵母菌、细菌等许多物质可被尿流式细胞仪误认为红细胞，而可被UF-100误认为白细胞的物质相对较少；②景深（视野在纵向的清晰范围）不足：使用显微镜镜检时，对放大400倍的高倍镜来说，景深远远小于计数池高度，致使镜下同一视野范围内的有形成分不能同时看清晰；③离心原因：使用定量板镜检法需要离心，而使用尿流式细胞仪不需要离心，也是导致两种检测方法差异的原因。尿液在离心过程中有形成分会破碎、溶解、浓缩不足或非病理成分浓缩影响计数；还有作者指出尿中各种颗粒在离心过程中可能黏附在管壁上造成结果不精确。

表2-23　尿全自动分析的报告内容

由于流式细胞计数、尿干化学分析仪及显微镜检的原理不同，造成了正常参考值的差异，在三者中，前两者做为过筛检查（现已二合一），当出现异常时，必须要经显微镜检测，三者之间各有所长，相互弥补，扬长避短。临床工作中常常联合检查（见表2-24）。

表2-24　三种尿检方法检出率的比较（%）

摘自：江西医学检验2001，19（1）：5