菠萝蛋白酶制备与活力测定

2023-12-07 理论教育版权反馈

【摘要】：实验七菠萝蛋白酶的制备及酶活力测定1.实验目的理解并掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和操作方法。菠萝蛋白酶活力测定①取酶制品0.15g，加入0.15mol/L磷酸缓冲溶液定容至100ml。

实验七　菠萝蛋白酶的制备及酶活力测定

1.实验目的

（1）理解并掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和操作方法。

（2）掌握蛋白酶活力的测定方法。

2.实验原理

菠萝蛋白酶是菠萝下脚料综合利用的重要产品之一，其用途十分广泛，在医学上用其医治炎症等多种疾病，同时在制革、食品、饮料等生产过程中也有很多应用。

菠萝蛋白酶是一种较不稳定的酶，提取过程中的每一个工艺步骤都对其产品活性有较大的影响。本实验采用单宁沉淀法提取菠萝蛋白酶，其中所使用的锌离子、硫代硫酸钠对酶有激活作用；乙二胺四乙酸根是一种螯合物，可有效地螯合原料中的重金属离子，以避免其与酶结合而使酶失去活性；抗坏血酸则具有还原性质，分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态，从而有效地保护酶活性；此外，EDTA和L-半胱氨酸联合使用，可达到最佳的保护酶活性的效果。制备的酶膏经-12℃以下冻结后，体积膨大，在进行成品干燥时不至于板结，有利于酶活性的保护。

3.实验试剂和材料

（1）5%苯甲酸钠溶液（防腐剂）。

（2）0.2%单宁溶液（沉淀剂）。

（3）洗涤剂Ⅰ：0.1%乙二胺四乙酸二钠、1.5%氯化钠溶液。

（4）洗涤剂Ⅱ：0.5%乙酸锌溶液、0.06%抗坏血酸溶液、1.5%氯化钠溶液、0.5%EDTA液。

（5）洗涤剂Ⅲ：0.5%硫代硫酸钠溶液、1%L-半胱氨酸溶液10ml（配制方法：称取L-半胱氨酸0.1g，加水10ml，加1mol/L盐酸溶液6~8滴助溶解，最后用6mol/L的NaOH溶液中和至pH3~4）。

（6）0.05mol/L（pH7.0）磷酸缓冲溶液。

（7）激活剂：内含15mmol/L硫代硫酸钠及6mmol/LEDTA-2Na的0.05mol/L（pH7.0）磷酸缓冲溶液，现用现配。

（8）1%酪蛋白。

（9）1mol/L氢氧化钠。

（10）菠萝。

4.实验仪器

榨汁机、离心机、冰箱、干燥器、紫外分光光度计。

5.操作步骤

（1）制备果皮汁(www.chuimin.cn)

选取70%~80%成熟度的去刺菠萝肉或菠萝皮，榨成汁后用4层纱布过滤的鲜果皮汁。

（2）菠萝蛋白酶的提取

①称取1kg制备好的鲜果皮汁，加5%苯甲酸钠溶液10ml，搅匀，以4000r/min离心7分钟，取上清液倒入干净烧杯中。

②在上清液中缓缓加入0.2%的单宁溶液75ml，边加边搅拌，约15分钟沉淀物析出，然后静止40分钟。

③虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心管中，以4000r/min离心5分钟，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。

（3）分离、洗涤和保护

①把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中，加0.1%EDTA溶液100ml搅匀，再加入1.5%氯化钠溶液200ml，搅匀，4000r/min离心7分钟，倒掉上清废液，得到洗涤剂Ⅰ酶复合沉淀物。

②在洗涤剂Ⅰ酶复合沉淀物中加入0.5%乙酸锌溶液20ml，搅拌均匀，静止5分钟；再加0.06%抗坏血酸溶液30ml，搅拌均匀，静止5分钟；再加1.5%氯化钠溶液20ml，搅拌均匀，静止5分钟；最后再加0.5%EDTA溶液20ml，搅拌均匀，静止5分钟；4000r/min离心7分钟，弃掉上清废液，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。

③在洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物中加0.5%硫代硫酸钠溶液20ml，搅拌均匀，静止5分钟；再加1%L-半胱氨酸溶液10ml，搅拌均匀，4000r/min离心7分钟，弃掉上清废液，最后得到蛋白酶糊。

（4）冷冻、干燥

把提取的酶糊放入-12℃冰室中，低温冷冻15~20小时。取出解冻，离心得酶膏，把酶膏倒入装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6~10小时，得到干酶，研磨成粉状，低温保存。

（5）菠萝蛋白酶活力测定

①取酶制品0.15g，加入0.15mol/L（pH7.0)磷酸缓冲溶液定容至100ml。过滤，滤液为溶液酶制剂。

②取溶液酶1ml，加入0.9ml激活剂，于37℃水浴中保温恒定。

③加入37℃预热的1%酪蛋白溶液，混匀，在37℃下准确反应10分钟。

④加入8ml1mol/LNaOH溶液，迅速摇匀，于室温放置半小时。

⑤取上清液于275nm波长下测定OD值。在上述条件下，单位时间内光吸收单位的变化值为待测溶液酶的活力。

6.结果分析

计算菠萝蛋白酶制品的酶活力。

7.思考题