实验六动物药物卵磷脂制备1.实验目的学习脂类药物的制备方法。磷脂类药物在临床上应用的主要有卵磷脂及脑磷脂，二者都有增强神经组织及调节高级神经活动作用，又是血浆脂肪良好的乳化剂，有促进胆固醇及脂肪运输作用，临床上用于治疗神经衰弱及防止动脉粥样硬化。......
2023-12-07
制备限制性内切酶-生物技术制药实验
【摘要】：实验九限制性内切酶的制备1.实验目的了解制备限制性内切酶的一般操作过程，掌握磷酸纤维素柱色谱纯化蛋白的方法。用冰浴保持菌液温度不超过10℃。⑤外切酶的检测将有内切酶活性的洗脱液与底物长时间保温，观察电泳图谱有无变化。
实验九 限制性内切酶的制备
1.实验目的
了解制备限制性内切酶的一般操作过程，掌握磷酸纤维素柱色谱纯化蛋白的方法。
2.实验原理
淀粉芽孢杆菌H（RUB500)菌株中含有极高量的限制性内切酶BamHⅠ，因而是制备BamHⅠ内切酶的良好材料。菌体经溶菌酶处理、超声波碎菌后离心，即得粗酶液，再经磷酸纤维素色谱使内切酶和杂蛋白（包括外切酶）分开。
3.实验试剂与材料
（1）缓冲液Ⅰ：7mmol/Lβ-巯基乙醇，80mmol/LNaCl，10mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.0。
（2）缓冲液Ⅱ：2mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5mmol/LEDTA，50%甘油，50mmol/LTris-HCl缓冲液，pH7.5。
（3）缓冲液Ⅲ：50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0），10mmol/LMgCl2，50mmol/LNaCl，1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）。
（4）缓冲液Ⅳ：50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5），0.5mmol/LEDTA-Na2，1mmol/LDTT，500mg/mlBSA。
（5）电泳缓冲液：50mmol/LTris-HCL缓冲液（pH7.8），0.25mmol/LEDTA，125mmol/L乙酸钾。
（6）溴酚蓝-蔗糖液：2.5g/L溴酚蓝，400g/L蔗糖。
（7）蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、利福平（12.5mg/ml）、溶菌酶、磷酸纤维素P11、NaCl、1mol/LNaOH、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、λDNA、琼脂糖凝胶、0.5mg/ml溴化乙啶、聚乙二醇（PEG12000）。
（8）培养基（g/L）：
蛋白胨10、酵母浸膏5、牛肉浸膏3、NaCl3、K2HPO43.6、KH2PO41.3，用1mol/LNaOH调pH值到7.4，121℃高压灭菌20分钟。
（9）菌株：Bacillusamylotiguefacians的自发利福平突变株——淀粉芽孢杆菌H（RUB500）。
4.实验仪器
恒温振荡器、超声波破碎仪、冷冻离心机、蠕动泵、低温超级水浴箱、部分收集器、紫外分析仪、紫外检测器、梯度洗脱装置、水浴箱、色谱柱、平板电泳槽及直流稳压电源、高压灭菌锅、超净工作台、显微镜等。
5.操作步骤
（1）菌株培养
①将一支冷冻干燥菌种接种在固体斜面培养基上，37℃培养24小时。
②用接种环转种在装有150ml培养基（内含12.5mg/ml利福平）的500ml锥形瓶中，接种6个锥形瓶，37℃培养6小时，达对数生长后期。
③7000r/min离心10分钟，弃上清，用缓冲液Ⅰ洗1次。
（2）菌体破碎及抽提
①以每克湿菌体加5ml缓冲液Ⅰ悬浮菌体，然后加入溶菌酶，室温搅拌（100r/min）30分钟。
②用超声波破碎仪破碎菌体，每次持续1分钟，间歇30秒，共12次。用冰浴保持菌液温度不超过10℃。
③镜检，如大部分细胞未破，还需继续破碎。(www.chuimin.cn)
④将超声波处理后的悬液于4℃，3000r/min，离心1小时，取上清，即为酶粗提液。
（3）磷酸纤维素色谱纯化酶粗品
①磷酸纤维素的处理
a.取12.5g磷酸纤维素P11，悬浮于400ml0.2mol/L盐酸-乙醇溶液（0.2mol/L盐酸-95%乙醇=1∶1，体积比），在室温下温和搅拌30分钟。
b.待浆液下沉，将上清倾掉，以除去细小的颗粒和其他的颗粒状物质。
c.抽滤收集树脂状沉淀物，再悬浮于400ml蒸馏水中洗涤，反复洗涤2~3次。
d.用2mol/LNaOH调pH值至中性，将此纤维素悬浮于0.1mol/LNaOH溶液，室温搅拌30分钟。
e.抽滤收集，并用蒸馏水洗涤3次。
f.用1mol/L盐酸调pH值近于中性，用缓冲液Ⅰ浸泡贮存备用。
②装柱先将部分缓冲液Ⅰ倾入柱内，然后将悬浮的纤维素慢慢倒入柱内（注意不要产生气泡），同时打开柱下面的出口，使纤维素随缓冲液慢慢流下而均匀沉降到色谱柱底部，不断补充均匀悬浮液，直到装成（1.5cm×20cm）的柱床，放置于4℃，并用4℃的缓冲液Ⅰ流洗平衡。
③加样及洗脱
a.将柱中缓冲液Ⅰ逐渐放出，当顶部液面近于柱床表面时（不能露出床面）开始加样，上样速度0.8ml/min。
b.当样品全部渗入床面时，用缓冲液Ⅰ进行洗脱，同时打开紫外检测仪，一直洗至A280接近于零。
c.最后用含0.08~0.8mol/LNaCl的缓冲液Ⅱ和Ⅲ各400ml进行梯度洗脱，流速0.7~0.8 ml/min，打开部分收集器，每管收集4.5ml。
④酶活性的检测（琼脂糖凝胶电泳法）
a.取10μl从色谱柱中所得的部分，加入缓冲液Ⅱ体系中，再加入λDNA底物（0.1~0.2μg），反应总体积为40μl。
b.37℃保温1小时，60℃加热10分钟，加入10μl溴酚蓝—蔗糖液。
c.在0.9%琼脂糖凝胶上电泳。电压为130v，室温下泳动6小时。
d.在254nm紫外灯观察，找出有酶活性的洗脱液管号。
⑤外切酶的检测
将有内切酶活性的洗脱液与底物长时间保温（15~24小时），观察电泳图谱有无变化。（如有外切酶，则电泳图谱上条带模糊或消失；如电泳图谱没用变化可认为不含或很少含有外切酶。）
⑥酶液浓缩
把具有BamHⅠ酶活性而无外切酶活性的各管装入透析袋，外加聚乙二醇（PEG12000），待体积浓缩至1ml左右，用缓冲液Ⅱ透析过夜（如需冷冻干燥改用缓冲液Ⅰ透析），然后加入缓冲液Ⅳ后冷冻干燥。
6.结果分析
（1）画出内切酶洗脱液与底物长时间保温的电泳图谱的变化。
（2）说明所制备的酶是否有活性。
有关生物技术制药实验的文章
- 详细阅读
-
红曲霉色素制备实验-生物技术制药实验七详细阅读
实验七红曲霉摇瓶发酵制备红曲霉色素1.实验目的通过红曲霉红曲色素的发酵制取过程，掌握菌种制备、培养基制备、发酵过程控制、发酵中间参数测定等微生物发酵的基本流程和技术。研究表明，产红曲色素的红曲霉代表菌株有3种，其中以紫红曲霉的红曲色素产量最高。b.红曲色素标准溶液制备准确称量1mg红曲色素标准品，用乙醇定容至10ml，于4℃低温保存。制备含填充剂红曲色素、离心、喷雾干燥成品，计算色素回收率。......
2023-12-07
-
糖化酶制备及活力测定-生物技术制药实验详细阅读
实验八糖化酶的制备及酶活力测定一、糖化酶的制备1.实验目的掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。......
2023-12-07
-
生物技术制药实验：基因工程干扰素的制备详细阅读
实验一基因工程干扰素的制备1.实验目的学习利用基因工程技术制备干扰素的过程。早期干扰素是用病毒诱导人白细胞产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要。现在主要是利用基因工程技术构建基因工程菌、转化大肠杆菌并在大肠杆菌中发酵、表达来进行干扰素的大规模生产。构建基因工程菌①分级分离生产干扰素的白细胞中的mRNA，得到高活性的12SmRNA。......
2023-12-07
-
生物技术制药实验：组织块培养技术详细阅读
实验二十九组织块培养技术1.实验目的学会组织块的培养技术，观察组织块的组织学生长行为。组织块法特别适合于组织量少的原代培养，但组织块培养时细胞生长较慢，耗时较长。注意有无污染，已贴壁的组织块边缘有无细胞“长”出。组织块的取材要尽可能快，以免组织块因取材时间过长引起细胞状态不好，将会导致后期培养。......
2023-12-07
-
免疫印迹杂交实验-生物技术制药实验详细阅读
实验十六Northern印迹杂交1.实验目的学习用标记探针杂交分析RNA样品中特定mRNA的大小及丰度。Northern印迹基本原理与Southern印迹类似，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，否则将会引起RNA的水解。本实验以毛细管虹吸印迹法为例介绍RNA的转移过程，此方法稍加修改后也可用于Southern印迹。Northern印迹上述电泳后的凝胶一般不需进行处理即可直接进行印迹。......
2023-12-07
-
酵母蔗糖酶纯化与测定-生物技术制药实验详细阅读
实验三十九酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定一、酶的纯化1.实验目的掌握酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定方法及原理。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm下的光吸收值，并用尿糖试纸进行半定量测定各管的酶活力，将最高酶活力的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。尿糖试纸是固定化酶应用于临床检测糖尿病的实例。......
2023-12-07
-
生物技术制药实验-常用仪器设备简介详细阅读
附录——常用仪器设备简介一、灭菌器（一）高压蒸汽灭菌器1.构造：该设备是利用压力饱和蒸汽对物品进行迅速而可靠的消毒灭菌设备。高压蒸汽灭菌器盖上装有排气阀、安全阀，以调节灭菌器内蒸汽压力。高压蒸汽灭菌是利用饱和水蒸气121℃、15分钟来进行，高温饱和水蒸气可迅速使蛋白质变性，在规定操作条件下，蛋白质发生变性的过程即微生物死亡的过程。如上述物质熔化，则说明高压蒸汽灭菌器内的温度已达要求，灭菌的效果是可靠的。......
2023-12-07
相关推荐