生物技术制药实验：基因工程菌发酵

2023-12-07 理论教育版权反馈

【摘要】：实验一基因工程菌的发酵工艺1.实验目的了解基因工程菌发酵的一般工艺以及发酵过程的参数控制。应用基因工程技术改造的工程菌在发酵表达时，诱导起始菌浓度、诱导物浓度、诱导时间等对其也会产生影响。在火焰保护下拔下瓶塞，将菌种液小心迅速倒入发酵罐，盖上接种盖并拧紧、灭火焰，用酒精棉擦洗接种口周围。

实验一　基因工程菌的发酵工艺

1.实验目的

了解基因工程菌发酵的一般工艺以及发酵过程的参数控制。

2.实验原理

发酵的本质是一种生化反应，与温度、pH、溶解氧、基质浓度等因素密切相关。应用基因工程技术改造的工程菌在发酵表达时，诱导起始菌浓度、诱导物浓度、诱导时间等对其也会产生影响。

3.实验材料及试剂

hIL-18工程菌甘油种、蛋白胨、酵母抽提物、NaCl、氨苄西林（AP）、培养皿、接种针、EP管、50ml和500ml离心管、10ml带盖螺口试管、500ml摇瓶。

4.实验仪器

超净工作台、离心机、温控摇床、发酵罐及周边设备、分光光度计、垂直电泳装置、天平。

5.实验步骤

（1）配制发酵培养基、在位灭菌及设定发酵参数（提前一天）分别配制1%细菌培养用蛋白胨，0.5%酵母抽提物和1%氯化钠，混匀后加蒸馏水定容至5L，转入10L发酵罐，121℃在位高压蒸汽灭菌30分钟。发酵参数设定为：37℃培养3小时，42℃诱导表达5h，溶氧30%以上，搅拌转速为300rpm。

（2）活化菌种

取低温保存的hIL-18工程菌甘油种，接种于含2mLLB+AP培养基的螺口试管（接种量1%（v/v）），37℃培养12小时。

（3）制备种子液

取活化菌种1ml接种于含100mlLB+AP培养基的摇瓶〔1%（v/v）接种量〕，37℃培养过夜。将菌种过夜培养物接种于含100mlLB+AP培养基的摇瓶〔10%（v/v）接种量〕，共接种5瓶（500ml），37℃培养至对数生长期（OD₆₀₀≈0.6），作为种子液。

（4）接种

将培养好的500ml种子液接入到发酵罐中（无菌操作）。

（5）分析发酵进程

每组8～9人，老师介绍发酵过程控制，同时完成不同时段的取样。每组负责测定一个时间点的光密度值，同时制备8～9个平行样品供发酵进程分析用（SDS-PAGE），注意做好标记。每次取样约30ml，2ml用于测光密度，1ml用于测定目标蛋白含量。

附录：发酵罐观摩讲解

1.发酵罐及其周边设备

发酵罐、空压机、蒸汽发生器、冷水机、摇床、离心机、板框过滤机、膜过滤装置、层析系统等。

2.发酵罐的结构(www.chuimin.cn)

罐体、搅拌电机、接管：进料管、补料管、接种口、压力表接管、取样管、仪表接管（pH、T、DO电极）。

罐内：搅拌器、联轴器、、挡板、消泡器。

中间层：夹套。

图2-1　发酵灌

3.主要参数

pH2～12±0.1，DO5～100%±1%

输入空气压力<0.2MPa

输入空气流量>10L/min

输入蒸汽压力<0.35MPa

4.主要操作

清洗－试车－空消－实消－接种－取样。

（1）清洗

清洗前应取出pH、DO电极，按其要求保养存放。罐内清洗可结合进水进气、电机搅拌、加温一起进行，如多次换水仍清洗不洁净，则要打开顶盖用软毛刷刷洗罐内部件。

（2）试车

将电极、电机、电缆、进出气软管、冷凝器进出水接头安装就位。安装完毕后要对罐体内通气（0.05～0.08MPa）作密封性试验。对系统进行2～3小时试运行后无问题，方可正式使用。

（3）空消和实消

结合设备及操作讲解。

（4）接种

当各测量参数显示正常且稳定，罐温稳定在设定接种温度时，开始接种。在灭菌酒精盘内加入医用无水酒精，打开上部出气调节阀，使罐压减小，慢慢打开接种盖。在火焰保护下拔下瓶塞，将菌种液小心迅速倒入发酵罐，盖上接种盖并拧紧、灭火焰，用酒精棉擦洗接种口周围。按工艺要求调节通气量和罐压。

（5）取样

在火焰保护下顺时针开启取样阀，取样后关闭取样阀并开蒸汽灭菌。

生物技术制药实验：基因工程菌发酵

相关推荐