细胞生长曲线测定方法-生物技术制药实验

2023-12-07 理论教育版权反馈

【摘要】：实验二十八细胞生长曲线的测定1.实验目的掌握测定细胞生长曲线的方法。了解细胞生长发育的特性。除使用计数法测定细胞的生长曲线外，还可用MTT比色法间接测量。生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。在需要确知细胞数量的场合不宜用MTT法。

实验二十八细胞生长曲线的测定

1.实验目的

（1）掌握测定细胞生长曲线的方法。

（2）了解细胞生长发育的特性。

2.实验原理

生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后经过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后，则停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数。通常计数7天。为精确起见，一般每次计数3瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的对数生长期，呈平台状的平台期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数（10⁴/ml）对培养时间（h或d）作图，即得生长曲线。

除使用计数法测定细胞的生长曲线外，还可用MTT比色法间接测量。MTT比色法的主要原理是：MTT被活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲臜，甲臜被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值（OD），在一定范围内光吸收值（OD）与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量OD值，间接测量活细胞数量。生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数生长期的1/3～1/2处加药。细胞计数的时间和次数则依实验目的而定。

3.实验材料与试剂

培养细胞，培养基（RPMIl640或DMEM），小牛血清，Hanks液，0.25%胰蛋白酶溶液（胰酶），0.5%台盼蓝染液，MTT（四甲基偶氮唑盐，5mg/ml溶于PBS），SDS脱色液：0.01mol/LHCl，10%SDS或DTW脱色液：1份TritonX-100溶于3份DMF（N，N二甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加2份去离子水，加柠檬酸至终浓度0.2mol/L，调pH至5～6。

4.实验仪器与器材

CO₂培养箱、倒置显微镜、酶标仪、微量加样器、血球计数板、培养瓶、试管、吸管、移液管、废液缸、专用盖玻片、96孔板。

5.实验步骤

细胞计数法测定细胞生长曲线

（1）取生长状态良好的细胞，经胰酶消化，用新鲜培养基制成细胞悬液后计数。如为悬浮生长细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。

（2）根据细胞计数结果按每个小方瓶5×10⁴每毫升作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。

（3）24小时后开始计数细胞，以后每隔24小时计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数,计算平均值。连续计数7天。

（4）根据细胞计数结果，以单位细胞数（细胞数/ml）为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

MTT法测定细胞生长曲线(www.chuimin.cn)

（1）取生长状态良好的细胞，常规消化制成单细胞悬液，计数，以2×10⁴均匀接种于96孔培养板。

（2）37℃,5%CO₂浓度，饱和相对湿度培养箱中培养，24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时后，每孔加入20μlMTT溶液，继续培养4小时后终止培养。

（3）弃上清，每孔加入150μlDMSO,震荡10分钟，用酶标仪于490nm或570nm处检测各孔OD值。以未接种细胞只加培养液孔作为空白对照调零。