植物组织培养基的配制与灭菌

2023-12-07 理论教育版权反馈

【摘要】：实验十八植物组织培养培养基的配制与灭菌1.实验目的掌握植物组织培养培养基的配制方法及操作过程。⑤将培养基煮沸，趁热分装到50ml三角瓶内，每瓶15～20ml左右，用封口膜包扎瓶口后，120℃高压蒸汽灭菌15分钟。

实验十八植物组织培养培养基的配制与灭菌

1.实验目的

掌握植物组织培养培养基的配制方法及操作过程。

2.实验原理

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

3.实验试剂

萘乙酸（NAA），6-苄基氨基嘌呤（6-BA），1mol/LNaOH，1mol/LHCl，蔗糖，琼脂，重蒸水，其他试剂见表1-14MS基本培养基母液。

4.实验器材

电子天平、高压蒸气灭菌锅、烧杯、容量瓶、试剂瓶、pH计、药勺、玻璃棒、电炉。

5.实验步骤

（1）MS培养基母液的配制

按照表1-14分别配制，在4℃冰箱保存。

（2）MS培养基的配制

①将各种培养基母液按比例混合：大量元素：微量元素：铁盐：有机营养=10∶1∶1∶1。

②分别加入一定浓度的NAA和BA（可自己设计不同浓度）。慢慢放出液体，使液面与树脂表面刚好相平。树脂床高度为8~10cm。

（4）加样将RNA水解液小心地加到交换树脂上，待样品全部进入树脂后，用50ml去离子水洗柱，以除去核苷、碱基等杂质。

（5）洗脱用蒸馏水洗至不含紫外吸收物质（OD260低于0.02）时，依次用下列洗脱剂分段洗脱：500ml0.02mol/L甲酸溶液；500ml0.15mol/L甲酸；500ml0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠溶液；500ml0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠溶液。控制流速0.8~1.0ml/min,用部分收集器洗脱，分管各收10ml。

（6）分析检测以相应的洗脱剂为对照，用紫外分光光度计测定各管洗脱液的OD260值，以洗脱液体积为横坐标，OD260为纵坐标作图，分析各部分的峰波位置。四种常见的单核苷酸的洗脱顺序为CMP、AMP、UMP、GMP。(www.chuimin.cn)

6.注意事项

（1）树脂的预处理过程中，先取强碱性阴离子交换树脂，用水浸泡，注意浸泡要充分，以保证树脂有效利用度。另一方面，经水浸泡后的树脂把水滤干后还要按照0.5mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸、1mol/L甲醛顺序依次进行浸泡可确保将树脂转为甲酸型。

（2）装柱时特别要注意，将处理好的树脂悬浮液倒入柱内过程中，动作一定要缓慢，不能太快，以免将气泡引入树脂影响分离效果。

七.思考题

（1）在柱子预处理过程中要注意的是？

（2）为什么在装柱过程中要避免将气泡引入树脂内？

表1-14　MS基本培养基母液