蛋白质印迹分析结果，适用于生物技术制药实验

2023-12-07 理论教育版权反馈

【摘要】：实验十四蛋白质印迹分析1.实验目的掌握Westernblot技术的基本原理，学习Western blot技术的实验方法，了解Westernblot技术的应用范围。

实验十四蛋白质印迹分析（Western blot）

1.实验目的

掌握Westernblot技术的基本原理，学习Western blot技术的实验方法，了解Westernblot技术的应用范围。

2.实验原理

Westernblot（又称蛋白质印迹或免疫印迹）技术，是以蛋白质为检测对象，抗体作为“探针”，用标记的二抗作为“显色剂”。本实验采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）先将蛋白质样品分离，之后再转移到固相载体（PVDF尼龙膜或NC膜）上；固相载体可以非共价键形式吸附蛋白质，且保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变；然后再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体（一抗）发生免疫反应，特异性一抗再与酶耦联的第二抗体[¹²⁵I标记的A蛋白或抗免疫球蛋白、与辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白]反应，最后在酶的作用下，导致底物显色或化学发光显影，来检测经电泳分离的特异性靶蛋白。

蛋白质印迹技术结合了聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨力高、固相免疫测定特异性强、敏感度高等诸多优点，能从复杂蛋白混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。

本实验以在原核细胞中诱导表达的GAPDH蛋白作为待检蛋白，将诱导后的菌体蛋白经SDS-PAGE电泳后，以鼠抗GADH单克隆抗体作为一抗，碱性磷酸酶偶联的兔抗鼠IgG作为二抗，对GAPDH的表达情况进行检测。

1.固体相上的蛋白质2.针对蛋白质的特异性抗体，称为一抗3.带上辣根过氧化物酶针对一抗的抗体，称为二抗4.加入底物，在酶的作用下分解产生荧光

图1-13　Westernblot检测目的蛋白质原理图

3.实验材料和试剂

（1）诱导前菌体蛋白、诱导后菌体蛋白（在实验十二中，由学生自己制备)

（2）硝酸纤维素膜（NC膜）

（3）一次性手套

（4）滤纸

（5）1.5mlEp管

（6）SDS-PAGE试剂（见实验十二）

（7）转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH₂O定容至1000ml（48mmol/LTris.HCl，39mmol/L甘氨酸，0.037%SDS)。

（8）鼠抗GAPDH单克隆抗体

（9）碱性磷酸酶偶联的兔抗鼠IgG

（10）TBS：140mMNaCl，20mMTris（pH7.5）

（11）TBS-T（pH7.5）：TBST+0.05%吐温20（W/V）

（12）膜染色液：考马斯亮蓝0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH₂O118ml。

（13）脱色液：45ml甲醇，45mlddH₂O，10ml冰乙酸

（14）预染的蛋白分子量标准

（15）封闭液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的TBS中。

（16）显色液：化学发光剂（ECL）或DAB6.0mg，0.01mol/LTris-HCl（pH7.6）9ml，0.3%CoCl₂（w/v）；H₂O₂1μl。

4.实验仪器

垂直版电泳槽，电泳仪，凝胶摄像系统，转移电泳仪，恒温水浴，微量加样器。

5.实验步骤

（1）SDS-PAGE电泳

①安装垂直板电泳装置，配制12%的聚丙烯酰胺凝胶。

②样品处理

取两支Eppendorf管，分别加入诱导前菌体蛋白和诱导后菌体蛋白各20ul,再各加入20μl 2×上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟，短暂离心。

③上样：按下表顺序加样：

表1-12　加样顺序表(www.chuimin.cn)

④电泳：接通电源，将电压调至80V。当溴酚蓝进入分离胶后，把电压提高到150V,电泳至溴酚蓝距离底部1cm处，停止电泳。

（2）蛋白质从凝胶转移到NC膜上（半干式转移）

①取下胶板，小心去除一侧玻璃板，切去浓缩胶和分离胶无样品部分，将凝胶分成两半，含分子量标准的部分用考马斯亮蓝染色。

②平衡凝胶：测量剩余胶的大小，按该尺寸剪取一张硝酸纤维素和六张滤纸。用转膜缓冲液平衡5分钟。

③膜处理:将滤纸和NC膜，一同在转膜缓冲液中浸泡10分钟。

④转膜：a转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层厚滤纸、NC膜、凝胶、3层厚滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。b用支架夹紧上述各层，置电转移槽中，NC膜一侧靠正极，凝胶一侧靠负极。接通电源，15V转移1.5～6小时。转移时间长短依靶蛋白分子量大小来调节。c转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。d将有蛋白Marker的条带染色，放入膜染色液中50秒后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

注意：各层之间千万不要存有气泡。

（3）免疫检测包括被转印到膜上的靶抗原与第一抗体（特异抗体）反应、与酶标第二抗体（抗抗体）反应，以及用酶相应的底物处理后进行靶蛋白（抗原）信号检测。

①用TBS-T洗膜，5分钟×3次。

②加入封闭液（5%脱脂奶粉或2%牛血清白蛋白），浸泡被转印膜，室温或37℃（平缓摇动）反应1～3小时，以封闭转印膜上一些非特异性蛋白质的潜在结合位点，避免非特异性反应。

③弃封闭液，用TBS-T洗膜，5分钟×3次，振荡。

④将封闭好的转印膜浸入第一抗体溶液（按合适稀释比例）中，室温反应1～2小时或4℃反应12小时以上，保持平缓摇动。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

⑤弃一抗，用TBS-T分别洗膜，10分钟×3次，振荡。

⑥加入碱性磷酸酶偶联的二抗溶液［稀释方法同（4）］，室温下反应1～2小时，保持平缓摇动。

⑦弃二抗，用TBST洗膜，10分钟×4次，振荡。

（4）靶蛋白（抗原）检测

①化学发光剂（ECL）检测转印膜上靶蛋白信号（近年多用），具体操作按ECL说明书进行，然后于暗室中用膜对X光片曝光，将所得X光片上的信号条带进行灰度扫描，计算其积分光密度值。新问世的“化学发光数字成像分析仪”已将曝光、扫描与光密度分析集于一体，既减少信号损失，又方便结果保存，还节省胶片。

②显色反应检测转印膜上靶蛋白信号（以往常用），配制底物反应液：DAB6.0mg，加入0.01mol/LTris-HCl（pH7.6）9ml溶解，再加入0.3%CoCl₂（w/v）1ml，过滤。最后在临用前加入H₂O₂1μl。

将膜放入相应显色剂（DAB）中，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。阳性反应将在靶蛋白相对应的位置上出现有颜色的条带。

6.注意事项

（1）一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合组成。

（2）如果反应灵敏度不高，可增加凝胶的厚度到1.5mm（厚度超过2.0mm时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提高蛋白样品的上样量。

（3）滤纸、凝胶、转印膜、滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避免导致直接接触而引起短路。

（4）如果出现非特异性的高背景，可观察仅用二抗单独处理转印膜所产生的背景强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时间；并考虑延长每一步的清洗时间。

（5）一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预实验确定最佳条件。

（6）一般情况使用0.45μm的NC膜，0.1～0.2μm的小孔径膜只适合于分子量小于20kD的蛋白质。

（7）PVDF尼龙膜较NC膜柔软、结实、灵敏度高，易于操作且蛋白质结合能力强（PVDF膜可结合蛋白质480μg/cm²，而NC膜只能结合蛋白质80μg/cm²）；缺点是PVDF尼龙膜背景也高，需要加强封闭；此外，PVDF尼龙膜需在使用前先用甲醇处理5～10秒，以活化膜表面的正电基团，使它更容易与带负电的蛋白质结合，可增加蛋白质在膜上的吸附。

（8）使用化学发光检测时，试剂须按需要量临用前配置混合。

（9）由于使用X光胶片检测化学发光时不易控制曝光强度，而X光胶片的黑度水平仅仅是在一个很窄的曝光范围内呈线性关系，因此有条件可选用化学发光成像扫描系统进行精确定时连续检测，以得到最好信噪比的图像进行定量分析。

(10）DAB有潜在的致癌可能，操作时要小心仔细。

7.思考题

（1）SDS-PAGE电泳时，电压为何不宜太大？

（2）电转移应注意那些问题？

（3）哪些方法可检测转印膜上靶蛋白信号？

蛋白质印迹分析结果，适用于生物技术制药实验

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