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大肠杆菌中外源基因表达及检测

2023-12-07 理论教育版权反馈

【摘要】：实验十二外源基因在大肠杆菌中的表达及检测1.实验目的学习外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术及SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理；掌握垂直板电泳的操作方法；了解IPTG诱导的外源基因在大肠杆菌中表达的原理和蛋白印迹技术原理和方法。

实验十二外源基因在大肠杆菌中的表达及检测

1.实验目的

学习外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术及SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理；掌握垂直板电泳的操作方法；了解IPTG诱导的外源基因在大肠杆菌中表达的原理和蛋白印迹技术原理和方法。

2.实验原理

将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。在没有加入IPTG诱导剂的时候，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而抑制了外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制；在加入IPTG后，由于阻遏蛋白不能与操纵基因结合，此时DNA外源基因可大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS-PAGE进行初步鉴定。

不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂(如二巯基乙醇)共同作用下并加热蛋白质会解离，变性的蛋白质与SDS结合并由此而带上负电荷，不同的蛋白质结合SDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS-PAGE电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N,N,N￠,N￠-四甲基乙二胺（N,N,N￠,N￠tetrame thylethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate（NH4) 2S2O8，简称AP)或核黄素（ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis，简称PAGE）。

凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用（即分子筛作用），还具有浓缩作用。由于不连续电泳缓冲系统可将样品中的SDS-多肽复合物全部浓缩为极小体积，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时检测蛋白质的电泳分离效果。

单体丙烯酰胺和N，N-甲叉双丙烯酰胺的聚合

图1-11　SDS的分子式

图1-12　仪表

3.实验材料与试剂

（1）含有重组表达载体pET-B1,空表达载体pET28b的大肠杆菌BL21。

（2）细菌培养用的LB液体培养基，（含50μg/ml的卡那霉素）。

（3）LB平板（含50μg/ml的卡那霉素）。

（4）100mMIPTG。

（5）10mg/ml的溶菌酶（10mMTris-HCl，pH8.0配制）。

（6）考马斯亮蓝R250。

（7）30%（W/V）凝胶贮存液（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口罩）。丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g,加ddH₂O溶至100ml，用新华3号滤纸过滤，棕色瓶中4℃保存，每隔几个月必须重新配制。

（8）1.5mol/LTris-HCl，pH8.8;0.5mol/LTris-HCl，pH6.8。（9）10%SDS。

（10）10%过硫酸铵（AP，新鲜配制）。

（11）TEMED（四甲基乙二胺）。

（12）Tris-甘氨酸电泳缓冲液，pH8.3，可配成5×贮存液备用，临用前稀释。

表1-6　工作液

（13）样品处理液

Deionizedwater3.8ml

0.5MTris-HCl,pH6.81.0ml

Glycerol0.8ml

10%（w/v）SDS1.6ml

2-mercaptoethanol0.4ml

1%（w/v）bromophenolblue0.4ml

（14）染色液0.4%考马斯亮蓝-R250染色液

表1-7　染色液

4.实验步骤

（1）将冻存的含有重组表达载体pET-B1、空表达载体pET28b的大肠杆菌BL21划线接种于LB平板上，37℃培养过夜，直至平板上长出单菌落。

（2）挑取单菌落至5mlLB液体培养基中，培养至OD600=0.6左右,4℃放置过夜。(www.chuimin.cn)

（3）取2ml培养菌加入到48mlLB液体培养基中，继续培养至OD600=0.4～0.6。

（4）表达载体和重组载体都分别设有诱导组和非诱导组，诱导组加入终浓度为1mM的IPTG，非诱导组不加IPTG，25℃诱导培养12h。

（5）取1.5ml培养菌至离心管中，5000rpm离心1分钟，收集细菌。

（6）用1ml10mMTris-HCl（pH8.0）悬浮细菌，5000rpm离心1分钟，收集细菌。

（7）加入30μl的10mg/ml的溶菌酶，充分悬浮，4℃放置2小时以上。

（8）制备4%浓缩胶，12%的分离胶的SDS-PAGE胶。

表1-9　浓缩胶制备表

表1-10　分离胶制备表

（9）超声处理5分钟，12000rpm离心10分钟,取上清作为蛋白样品。

（10）取5μl测定蛋白浓度。

（11）取50μg蛋白上样，加入5μl上样缓冲液，沸水浴5分钟，短暂离心后上样。

（12）170V恒压电泳至溴酚蓝移至凝胶前沿。

（14）将胶剥下，于考马氏亮蓝染色液中染色1小时以上。

（15）再将胶置于脱色液中脱色至透明。

（16）观察结果：诱导的pET-B1菌液样品在分子量61kDa处有一明显的深厚条带，而其他三种处理没有此条带。

5.注意事项

（1）丙烯酰胺单体和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺有神经毒性，在称量和配制时要带一次性手套和口罩。

（2）凝固后一般不再有毒性，但考虑到可能会存在没有完全交联的分子，实验结束后不宜直接用手拿取，要先用清水漂洗5～10分钟。

（3）室温较低时胶液不易凝固，可以在槽中加37℃温水。

（4）SDS很容易漂浮在空气中而被吸入体内，称量时最好在通风橱中进行，或戴上口罩。

（5）在实际操作中，很容易将电极接反，请注意，负极永远接在加样孔的一端（即上负下正方向）。

6.思考题

SDS-PAGE电泳中浓缩胶和分离胶的作用分别是什么？

附录

影响蛋白质电泳分离效果的因素

（1）蛋白质样品中的盐浓度影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白时最好用去离子水，再加等量2×SDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行SephaderG25过柱。

（2）SDS的质量由于变性蛋白是与SDS结合而带负电荷，蛋白结合SDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同迁移率的电泳图谱。

（3）蛋白加样孔是否平齐，若加速度样孔不平齐，也会影响蛋白电泳的迁移率。

（4）为防止因相邻泳道样品间的扩散，而导致电泳条带的不整齐，如有空置的加样孔，须加等体积的1×SDS样品缓冲液。

电泳样品的准备

（1）浓度单一成分1～10μg，若浓度太稀，应沉淀后再进行电泳；对于非单一成分的样品，如基因工程大肠杆菌的表达产物，其蛋白量50～100μg可取得较好的分离效果。

（2）体积样品体积尽可能小，以保证电泳条带的整齐，必要时可应用6×SDS蛋白加样缓冲液以增加蛋白质的加样量。

（3）盐浓度应尽可能低，可用SephaderG25快速脱盐；钾离子（K⁺）要除去，否则钾离子可沉淀SDS，从而影响结果。

（4）如分离小分子肽时，可将分离胶的浓度提高至20%～25%。

（5）对照孔需加入的蛋白质分子量标准（即蛋白Marker）同样也须在100℃处理3～5分钟。

表1-11　被分离物质分子量与凝胶浓度的选择