组织学与胚胎学的研究技术与成果

2023-12-05 理论教育版权反馈

【摘要】：(四)免疫组织化学技术免疫组织化学技术是应用抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织细胞内多肽和蛋白质等大分子物质的技术。分离和纯化人或动物某种组织的蛋白质，作为抗原免疫动物，即可制备相应的特异性抗体。放射性标记物用放射自显影术显示，非放射性标记物可用组织化学术显示。

(一)光学显微镜技术

光学显微镜技术是一种常用技术。借助光学显微镜放大组织切片观察到的细胞组织微细结构，称光镜结构。切片制作程序:取人或动物的新鲜组织标本，入固定剂(如乙醇或甲醛溶液)，使组织中蛋白质迅速凝固，以尽可能保持其自然结构，此过程称为固定。固定后的标本经冲洗、脱水、浸蜡、切片等步骤后进行染色。最常用的染色方法是苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色，简称HE染色。苏木精是碱性染料(它的盐溶液具正电荷)，伊红为酸性染料(其盐溶液具负电荷)。如果某结构或物质被苏木精着色染成蓝紫色，称嗜碱性;被伊红染成粉红色，称嗜酸性;与碱性和酸性染料亲和力均不强者，则称为嗜中性。

此外，还可以把组织直接置于低温下冰冻，直接进行切片、染色，称为冰冻切片法。该法常用于酶的组织化学研究及病理快速诊断。

血液(或体液等)可直接涂在载玻片上进行染色称涂片法;坚硬组织(如骨、牙齿等)可用磨片法;一些软组织(如疏松结缔组织)可用铺片法。

(二)电子显微镜技术

1．透射电子显微镜技术透射电镜(TEM)是以电子束代替光源，以电磁透镜代替光学透镜，经聚焦放大后，显像于荧光屏上进行观察和摄像。电镜的分辨率可达0．2 nm，放大倍数可达几十万倍(图1－1)。

2．扫描电子显微镜技术扫描电镜(SEM)用于观察组织细胞的表面立体结构。标本表面先后喷镀一层碳膜和金属膜，即可置于电镜下观察(图1－1)。

在电子显微镜下看到组织细胞更细的结构，称电镜结构。

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图1－1　电子显微镜基本原理示意

(三)组织化学和细胞化学技术

组织化学(histochemistry)和细胞化学(cytochemistry)是通过化学反应或物理反应的原理显示组织细胞内某种化学成分，并可进行定位、定量研究。如欲检测组织细胞内的多糖类，可用过碘酸－Schiff反应(PAS反应)，其基本原理是多糖经过碘酸(HIO4)氧化成多醛，后者与Schiff试剂(无色品红)结合形成紫红色沉淀物，沉淀物形成部位则表示多糖存在的部位，颜色反应的深浅取决于组织内多糖的量。(www.chuimin.cn)

(四)免疫组织化学技术

免疫组织化学(immunohistochemistry)技术是应用抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织细胞内多肽和蛋白质等大分子物质的技术。分离和纯化人或动物某种组织的蛋白质，作为抗原免疫动物，即可制备相应的特异性抗体。将这种抗体用荧光素、铁蛋白、酶等标记，用这种标记的抗体孵育标本，标记抗体即与细胞的相应蛋白质(抗原)发生特异性结合。这种方法称为直接法(图1－2)。另一种方法是间接法:将分离的抗体(一抗)作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体的抗体(二抗)，然后对二抗进行标记。先后用一抗和标记二抗处理组织标本，最终形成抗原—一抗—标记二抗复合物(图1－3)。间接法由于二抗的放大作用而较直接法敏感性高。目前常用的间接法有过氧化物酶—抗过氧化物酶复合物法(PAP法)和亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(ABC法)。

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图1－2　免疫组织化学直接法
A．荧光抗体法B．酶标抗体法C．铁蛋白标记法

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图1－3　免疫组织化学直接法与间接法
A．直接法B．间接法

(五)原位杂交组织化学技术

原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry)简称原位杂交，可在组织细胞原位检测核酸分子。其基本原理是两条互补的单核苷酸链可紧密结合形成稳定的杂交体。碱基序列已知的标记核苷酸链称为探针，常用的标记物分放射性和非放射性两类。放射性标记物用放射自显影术显示，非放射性标记物可用组织化学术显示。

(六)细胞培养技术

将人或动物体的活细胞在体外适宜的环境中(如温度、pH值、营养等)培养生长的技术称为细胞培养技术。细胞培养技术可应用于细胞增殖、分化、代谢、吞噬及癌变机制等多方面的研究，获得体内实验难以达到的目的，已成为细胞学研究的重要手段之一。

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