酪蛋白纯化及鉴定研究成果公布

2023-12-04 理论教育版权反馈

【摘要】：酪蛋白的纯化和初步鉴定研究武汉东湖学院生命科学与化学学院涂毅，龙尧尧，彭勃，汪越，范苏秦，曹军卫从牛奶中分离酪蛋白的最佳工艺参数为：提取温度40℃，pH 4.8，乙醇用量20 mL/100 mL牛奶。α或κ-酪蛋白由于峰的归属不明尚无法确定含量，需其他实验方法作进一步鉴定。本研究的目的是对酪蛋白进行粗提后，通过不同的pH、盐离子浓度等洗脱方式的优化来确定分离提纯酪蛋白的最佳条件。

酪蛋白的纯化和初步鉴定研究

武汉东湖学院生命科学与化学学院

涂毅，龙尧尧，彭勃，汪越，范苏秦，曹军卫

从牛奶中分离酪蛋白的最佳工艺参数为：提取温度40℃，pH 4.8，乙醇用量20 mL/100 mL牛奶。本文探讨了离子交换层析分离纯化酪蛋白的实验条件，以pH 7时洗脱效果较为理想；连续梯度洗脱分离出了五个峰值，电泳分析得知纯化五种蛋白质的NaCl浓度分别为0.048mol/L，0.078mol/L，0.162mol/L，0.198mol/L，0.240mol/L，其中前两个浓度对应于洗脱γ和β-酪蛋白，且两种蛋白质的含量分别为0.32g，2.01g。α或κ-酪蛋白由于峰的归属不明尚无法确定含量，需其他实验方法作进一步鉴定。

一、前言

酪蛋白是乳中特有的，由乳腺上皮细胞合成的一组磷蛋白。酪蛋白中含有大量的磷和钙，以磷酸酯键与丝氨酸的羟基结合，含有少量己糖、氨基糖和唾液酸等残基。乳中酪蛋白分为α-酪蛋白，β-酪蛋白，γ-酪蛋白和κ-酪蛋白四种，它们各自都有不同相对分子质量和等电点的变异体。牛乳中α-酪蛋白约占50%，等电点约为4.1，分子量约为23000；β-酪蛋白约占30%，等电点约为4.5，分子量约为24000；γ-酪蛋白和κ-酪蛋白都只有很少一部分，γ-酪蛋白约占3%，等电点约为5.9，分子量约为31000；κ-酪蛋白约占10%，等电点4.1，分子量约为19000。

酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，与人们的生活也密切相关，需求量非常大，因此，确定一个好的分离提纯方法有着十分重要的意义。本研究的目的是对酪蛋白进行粗提后，通过不同的pH、盐离子浓度等洗脱方式的优化来确定分离提纯酪蛋白的最佳条件。

二、实验部分

（一）材料与试剂

脱脂奶粉(市售)，氯化钠，95%乙醇，SDS，考马斯亮蓝G-250，DEAE-c纤维素，Ampholine，牛血清白蛋白（BSA）等，均为分析纯。

TH-300梯度混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司 TH-300)，自动部分收集器(上海青浦沪西仪器厂 BS-100)，凝胶成像系统（Beijing Junyi-Dongfang Electrophoresis Instrument Co.，Ltd JYO4S型）等。

（二）方法

1.酪蛋白的粗提

（1）确定酪蛋白提取的最佳温度、pH、乙醇用量作为最佳提取条件。

（2）在最佳提取条件下提取酪蛋白样品。

2.离子交换层析

将1.5g已处理好的酩蛋白粗制品溶液离心后取其上清液上样。

选择不同离子强度的洗脱液进行连续梯度或不连续梯度洗脱。我们使用了以下两种方案。

（1）把起始缓冲液配成分别含0mol/L NaCl、0.22mol/L NaCl和含0.35mol/L NaCl的洗脱液在不同pH下进行不连续梯度洗脱。

（2）选择最佳pH进行连续梯度洗脱。

3.检测与鉴定

将有明显峰值的样品收集，进行SDS-PAGE电泳和等电聚焦电泳检测样品酪蛋白的组分；用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质的含量。

（三）结果与讨论

1.酪蛋白的提取

（1）温度的影响

酪蛋白在牛乳中以酪蛋白磷酸钙的形式存在，随着温度的升高，酪蛋白胶囊之间热碰撞频率增加，酪蛋白容易相互结合成块。但温度超过一定范围后，蛋白质的次级结构遭破坏，静电斥力增加，这就使酪蛋白结合变得困难而不易结块，导致酪蛋白得率下降。由图la可知，最适提取温度为40℃。

图1　提取条件对酪蛋白得率的影响（a：温度；b：pH；c：乙醇用量）

（2）pH的影响

由图1b可知，当pH值增至4.8左右时，酪蛋白的量最大；pH值继续升高，沉淀量会逐渐下降。其原因为蛋白质是两性化合物，等电点(pH 4.8)时酪蛋白的溶解度最小，会从牛奶中沉淀出来；偏离它的等电点时，酪蛋白胶粒静电斥力增大不易结合成块，提取量下降。

（3）乙醇用量的影响

由图1c可知，随着乙醇用量的增加，酪蛋白的提取量迅速减少。当用量达到30 mL左右时，提取量逐渐趋于稳定。因此，最适用量取20mL。

（4）最佳提取条件下提取酪蛋白样品

称取12g市售奶粉配成100mL溶液，经过粗提得到6.3g酪蛋白粗提品，收率为52.5%。

2.离子交换层析

（1）不同pH下的不连续梯度洗脱

① pH为7的不连续梯度洗脱。

依次采用0mol/L、0.22mol/L 、0.35mol/L pH 7.0的NaCl溶液洗脱，其中69管处的A280达到2.046，出现一明显峰值（图2a）。之后未出现峰值。(www.chuimin.cn)

（a：pH 7；b：pH 6；c:pH 8）

图2　不同pH的NaCl不连续梯度洗脱曲线

图3　连续梯度洗脱曲线（a）与NaCl浓度梯度（b）

②pH为6的NaCl洗脱液洗脱

将NaCl溶液的pH调为6，其他条件不变。在61管出现一个明显的峰值（图2b），达到2.035，之后再未出现峰值。为何出峰时间比pH 7时要早，这是由于酪蛋白等电点是4.7，在pH为7时所带电荷要大，故洗脱下来更难一些。

③pH为8的NaCl洗脱液洗脱

换用pH为8的NaCl溶液洗脱，只得到了一个明显的峰值（图2c）。

由图2可知，在盐离子浓度不变的情况下，pH的改变只会改变洗脱的难易，pH为8时最难洗脱。考虑到出峰快慢可选择pH 7洗脱最合适。

（2）最佳pH下的连续梯度洗脱

洗脱速度为0.5mL/min、洗脱缓冲液pH为7，梯度混合仪两边盛放离子强度为0 mol/L和0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱。洗脱曲线如图3a所示，得到5个峰，编号为1—5，洗脱浓度与管数之间的对应关系如图3b所示。5个峰值所对应的NaCl浓度依次为0.048mol/L，0.078mol/L，0.162mol/L，0.198mol/L，0.240mol/L。

3.SDS-PAGE电泳

将5个峰值对应的样品进行收集，SDS-PAGE电泳图谱如图4所示。

图4　SDS-PAGE电泳图谱

图5　考马斯亮蓝法工作曲线

（M为酪蛋白的粗提品，1—5泳道依次对应5个峰值的样品）

由图4可知，3、4、5泳道对应的样品条带处于同一水平，考虑到没有其他蛋白质的影响，故它们的分子量相同，可能为同一种酪蛋白，且与1和2的条带明显不同，因此分离出了至少三种不同分子量的酪蛋白。

4.等电聚焦电泳

通过等电聚焦电泳，测出峰1样品的pI为4.9，峰2样品的pI为4.7，峰3、4、5样品的pI都为4.1。对比四种酪蛋白的等电点，推测峰1对应的是γ-酪蛋白，峰2对应的是β-酪蛋白，峰3—5对应的是α或κ-酪蛋白。

5.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质的含量

用考马斯亮蓝G-250法作工作曲线，如图5所示。得到线性拟合曲线方程为

Y=-0.00613+0.01415X（R=0.99885）

可计算得γ-酪蛋白的浓度为0.32mg/mL，β-酪蛋白的浓度为2.01mg/mL，α或κ-酪蛋白由于峰的归属不明尚无法确定浓度。推测12g牛奶中的γ-酪蛋白为0.32g，β-酪蛋白为2.01g。

三、小结

（1）分离酪蛋白最佳工艺：提取温度40℃，pH4.8，乙醇用量20mL/100mL牛奶。

（2）离子交换层析 pH 7时洗脱效果较为理想，但是几种酪蛋白未分离开，可能是离子浓度的大小影响了洗脱的效果。进行连续梯度洗脱分离出了5个峰值，电泳分析得知纯化五种蛋白质的NaCl浓度分别为0.048mol/L，0.078mol/L，0.162mol/L，0.198mol/L，0.240mol/L，其中前两个浓度对应于洗脱γ和β-酪蛋白，且两种蛋白质含量分别为0.32g，2.01g。

（3）α或κ-酪蛋白由于峰的归属不明尚无法确定含量，需其他实验方法作进一步鉴定。

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