苗种繁育岗位年度工作综述2013

2.1　鲆鲽类人工繁殖及苗种培育技术改进的生产性实验研究

牙鲆与夏鲆种间杂交制种材料体系的构建：通过构建家系筛选牙鲆与夏鲆种间杂交组合18对，其中雄性夏鲆12尾，留种保育；对留种雄性亲本进行性腺发育人工诱导获得大量优质精子，并进行冷冻保存，共冻存优质精子200余毫升；培育夏鲆家系4个，混合养殖，并通过体长、体高、体重等多性状复合筛选，3月龄幼鱼初步筛选出10　000余尾，6月龄筛选出1　000余尾，作为优质夏鲆亲本留种。

优化种间杂交人工授精技术及杂交子代苗种培育技术工艺，利用筛选的亲鱼和保存的优质冷冻精子，获得夏鲆（♂）与牙鲆（♀）杂交受精卵14千克，杂交受精率78%以上，孵化率85%以上，苗种成活率58%以上；示范生产杂交鱼苗82.6万尾；推广生产杂交鱼苗130余万尾。

半滑舌鳎亲鱼培育及苗种培育：采用温光营养综合调控措施，提高半滑舌鳎亲鱼成熟率和利用率，并采用形态学特性、生态学指标和营养评价等方法，建立半滑舌鳎配子和苗种质量评价技术，培育优质半滑舌鳎亲鱼雌鱼3　000尾，雄鱼4　500尾，亲鱼成熟率达到了67%；获得成熟卵48kg，优质受精卵36kg，获得5～6cm的苗种500余万尾；采用温度调控等技术，提高鳎类雌性比例12%以上。

通过人工环境调控、营养强化和定量定频HCG诱导，实现亲鱼性腺发育成熟率90%；采用定量定频的激素诱导技术，建立星斑川鲽激素诱导雌性化育苗技术，生产高雌苗种32万尾，雌性比率为73%，苗种成活率为68%。应用伪雄鱼培育星斑川鲽21万尾，鱼苗雌性比例75%。

鲆鲽类雄性延长产精期技术的应用与推广：对夏鲆亲鱼实施人工处理和激素诱导解决了雄鱼性腺发育不良，精子质量低下的问题，并通过人工处理和激素诱导获得批量优质精子；同时，在鲆鲽类受精卵生产企业实施推广，获得良好的效果。

海水鱼类冷冻精子的应用：海水鱼类冷冻精子应用于牙鲆、大菱鲆等鱼类的异源精子诱导雌核发育实验、牙鲆与夏鲆种间杂交子代的苗种规模化生产、大菱鲆苗种生产及大菱鲆精子介导的转基因研究，无偿提供给企业、科研单位冷冻保存技术或冻精9批次，300余毫升，实现种质库资源的共享。

亲鱼的培育及优质受精卵质量评价：采集秋季大菱鲆受精卵30余批次，从卵子受精率、卵裂形态、孵化率、早期存活率、脂质组成等不同的层面判定鲆鲽类受精卵质量优劣，完善大菱鲆质量评价指标。

2.2　大菱鲆受精卵质量评价

本研究通过对大菱鲆受精卵生产进行现场跟踪并开展了受精卵质量评价研究。对2013 年10月15日至10月27日大菱鲆受精卵生产进行连续跟踪，共生产受精卵总量为207.3 kg，其中上浮卵为132.9kg，沉卵为74.3kg，沉卵占总卵量的35.8%。通过镜检结果显示，上浮卵的平均受精率为58.84%，理论出卵量应为77.96kg，而实际出卵量47.2kg，生产受精卵的实际出卵率为35.5%。

图1　大菱鲆受精卵生产情况

以往的研究发现，受精卵早期胚胎发育或仔稚鱼发育的畸形情况可以衡量受精卵的发育潜能。本研究通过卵裂形态综合分析方法，从受精卵分裂平衡性、受精卵卵裂大小均一性、受精卵分裂沟大小、受精卵分裂痕迹清晰度、受精卵分裂沟内含物有无等角度对受精卵质量进行了评价。通过对13批受精卵分析后结果显示，受精卵包括分裂平衡受精卵和分裂畸形受精卵，所占的比例分别为70.22%和29.78%。通过现场受精卵孵育实验显示，受精卵平衡分裂卵和畸形分裂卵的沉卵率存在显著差异（图2，图3，图4），平衡分裂卵的平均沉降率为22.61%，而畸形分裂卵的平均沉降率达56.04%。

图2　平衡分裂受精卵

图3　畸形分裂受精卵

图4　不同批次大菱鲆卵裂沉降率

2.3　雌核发育牙鲆规模化诱导及伪雄鱼诱导培育研究

2013年诱导获得了普通牙鲆异质雌核发育群体2个，分别获得初孵仔鱼约8　000尾，7　000尾。通过形态学观察鉴定UV照射精子DNA的灭活率为100%，经加倍获得了100%的雌核发育牙鲆。目前正在培育5月龄普通牙鲆异质雌核发育群体鱼苗共约100余尾（体重25.6kg±12.7kg，图5）。

图5　2013年批量诱导牙鲆异质雌核发育家系培育情况

2010年春季诱导获得的雌核发育牙鲆已经性成熟，2013年春季诱导异质雌核发育子二代群体1个，获得初孵仔鱼约15　000尾。通过形态学观察鉴定UV照射精子DNA的灭活率为100%，经加倍获得了100%的雌核发育牙鲆。目前正在培育5月龄雌核发育牙鲆子二代异质雌核发育群体鱼苗约50尾（体重15.5g±10g，图6）。

图6　雌核发育牙鲆子二代异质雌核发育群体培育情况

2007、2008、2009年和2010年诱导获得的异质雌核发育家系和群体，继续进行常规培育，目前2007年诱导获得的5龄鱼在日照水产增殖站培育。2008年诱导获得的雌核发育群体和家系，目前尚有4龄鱼20余尾（体重1.84kg±0.52kg）。2009年诱导获得的雌核发育群体，目前尚有4龄鱼14尾（体重1.07kg±0.53kg）。2010年诱导获得的雌核发育牙鲆，目前还在培育家系2个，尚有36月龄成鱼70余尾（体重1.22kg±0.20kg），42月龄成鱼50余尾（因正在进行生产，并未进行测量）（图7）。

图7　异质雌核发育牙鲆培育情况
自左至右分别为2008、2009、2010年诱导

2013年通过升温对异质雌核发育牙鲆家系又进行了性反转诱导（图8）。

图8　2013年诱导异质雌核发育牙鲆伪雄鱼的培育

2009年年底通过升温对异质雌核发育牙鲆家系进行了性反转诱导，性腺切片检测其雄性比例为100%。现尚在培育4龄鱼38尾（体重0.68kg±0.15kg，图9）。

图9　牙鲆异质雌核发育伪雄鱼培育情况

2013年春季时，2010年春季诱导获得的雌核发育牙鲆已经性成熟，依此诱导同质雌核发育群体1个，获得初孵仔鱼约1　000尾。通过形态学观察鉴定UV照射精子DNA的灭活率为100%，经加倍获得了100%的雌核发育牙鲆。目前正在培育5月龄雌核发育牙鲆同质雌核发育群体鱼苗7尾（体重10.1g±3.4g图10）。

图10　雌核发育牙鲆子二代同质雌核发育群体培育情况

2008年诱导获得的同质雌核发育群体，目前尚有4龄鱼约10尾（体重1.4～2.3kg）。2012年诱导获得的同质雌核发育群体，目前尚有17月龄鱼约100尾（体重32.3g±11.7g，图11）。

图11　同质雌核发育牙鲆群体培育情况
左为2008年诱导，右为2012年诱导

2.4　牙鲆、大菱鲆多倍体诱导实验初步结果

2.4.1　牙鲆多倍体诱导参数的优化及批量化诱导

对诱导获得的牙鲆三倍体群体继续进行培育与观察。

2011年度批量诱导的牙鲆三倍体目前尚有23月龄苗种100余尾，流式细胞仪检测其三倍体率为100%。与二倍体相比，三倍体牙鲆表现出显著的生长优势（P＜0.05）（图12）。

图12　2011年诱导牙鲆三倍体及对照生长情况

2012年度批量诱导的牙鲆三倍体目前尚有17月龄苗种约50尾，与二倍体对照组相比并未表现出显著的生长优势（P＜0.05）（图13）。这可能与培育期间三倍体组养殖密度较高有关。目前已进行注射荧光标记进行混养以观察其后续生长情况（图14）。

图13　2012年诱导牙鲆二倍体、三倍体生长比较

图14　批量诱导牙鲆三倍体培育情况

对2012年诱导的牙鲆三倍体及其全同胞二倍体家系进行了取样固定，从群体遗传学角度分析其差异，期望能为探究其多倍体发生及生长优势的规律提供线索（图15）。目前已检测了20对引物，图片判读已完成，正在进行群体遗传学数据分析。

图15　引物Po1（上）和Po56（下）部分样品的PAGE检验结果

在以往实验基础上，使用同样的亲本进行了牙鲆四倍体家系的批量诱导，对其及其全同胞二倍体、三倍体家系进行了取样固定，从群体遗传学角度分析其差异，期望能为探究其四倍体发生的规律提供线索。目前已采取部分样品，正在进行群体遗传学分析。

2.4.2　大菱鲆多倍体诱导参数的优化及批量化诱导

根据前期实验结果，进一步优化了大菱鲆三倍体批量诱导实验的条件。并在优化的条件下诱导获得大菱鲆三倍体初孵仔鱼70　000余尾，经流式细胞仪或染色体制片检测其诱导率为100%。目前正在培育1月龄大菱鲆三倍体鱼苗30　000余尾，全长为1.4～1.7cm（图16）。

图16　大菱鲆三倍体鱼苗培育情况

在以往实验基础上，进一步摸索了大菱鲆四倍体诱导实验的条件。进行了大菱鲆四倍体处理时刻、处理压力和处理时间的单因子实验，并进行了正交实验。通过对孵化率和诱导率的综合比较，初步得到了大菱鲆四倍体诱导的较适条件（图17）。

随后在较适条件下进行了大菱鲆四倍体的大批量诱导，获得大菱鲆初孵仔鱼40　500尾，诱导率为80%，对二倍体对照组及四倍体处理组的发育时序进行观察，并在不同发育阶段进行固定、取样，以研究其与二倍体对照在形态学、细胞生物学和分子生物学水平上的差异，期望能为探究其四倍体发生的规律提供线索。

观测发现，四倍体处理组的发育时序略晚于对照组，但并未观测到明显的形态学差异（图18）。目前正在对固定的样品进行细胞学以及卵裂相关基因差异表达的研究。

图17　不同处理时刻（A）、处理压力（B）和处理时间（C）对受精卵受精率、原肠胚成活率、孵化率及诱导率的影响

图18　大菱鲆对照组（上）与四倍体诱导组（下）的胚胎发育观察

2.5　褐牙鲆Paralichthys olivaceus与杂交鲆（褐牙鲆♀×大西洋牙鲆P.dentatus♂）耐热性相关研究

研究了在不同升温模式下褐牙鲆Paralichthys olivaceus与杂交鲆（褐牙鲆♀×大西洋牙鲆P.dentatus♂）组织结构及相关酶活力变化规律。慢性升温模式：将褐牙鲆和杂交鲆自养殖温度（24℃±0.5℃）开始升温，每升高1℃±0.5℃，在该温度下驯养5天，直到死亡率达到50%升温结束。急性升温模式：将褐牙鲆和杂交鲆自驯养温度（20℃±0.5℃）分别投入到20℃，26℃，28℃，30℃和32℃水体中，直到死亡率达到50%升温结束。利用常规组织学石蜡切片和HE染色观察发现，慢性升温模式下，褐牙鲆在30℃及32℃下鳃结构都出现较严重的破坏，而杂交鲆鳃丝及肝结构保持相对更完整，鳃的病理症状出现得更晚、更少；与代谢及免相关的酶活力分析表明褐牙鲆肝脏的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）和丙酮酸激酶（PK）的相对活力比杂交鲆波动更显著，且褐牙鲆中酶活力的变化波动与大量死亡爆发及组织学的变化基本一致。与杂交鲆相比，褐牙鲆对29℃和32℃更敏感。急性升温模式下也得到了类似的结果。通过上述结果我们推测：褐牙鲆对温度的升高具有较高的敏感性，而杂交鲆表现出对高温的相对不敏感也暗示了其可能具有更好的耐热性。

2.5.1　急性升温实验

（1）急性升温条件下累计存活率变化：(www.chuimin.cn)

对急性升温实验下累计存活率进行初步统计发现：除32℃组，褐牙鲆其余各组累计存活率均＞95%；杂交鲆其余各组累计存活率均＞98%。32℃下，褐牙鲆首先于1.5h出现死亡，累积存活率于4h低于50%；杂交鲆于4h出现死亡，累积存活率于12h低于50%。

（2）不同组织对高温的响应：

对26℃和32℃下的不同组织进行石蜡切片比较，发现皮肤和鳃是受高温影响最大的组织，由于鳃是研究外源刺激对鱼体影响的常用靶器官，故实验中选取鳃作为主要的研究对象。

图19　急性升温条件下累计存活率变化

图20　不同组织对高温的响应

（3）急性升温对鳃组织结构的影响：

对第二鳃弓进行石蜡切片比较组织变化发现：26℃，褐牙鲆的鳃发生轻微上皮位移；29℃时，褐牙鲆出现较严重的上皮位移，杂交鲆出现充血、动脉瘤等症状；32℃，褐牙鲆上皮位移严重，杂交鲆鳃丝充血，出现上皮位移。

图21　急性升温对鳃组织结构的影响

进一步对鳃组织进行透射电镜观察发现：29℃下，褐牙鲆上皮细胞出现较明显的变化；32℃下，褐牙鲆和杂交鲆的上皮细胞均发生严重的翘起，鳃结构破坏，对应鳃功能的丧失，死亡爆发。

图22　电镜观察急性升温对鳃组织结构的影响

（4）急性升温对相关酶活力的影响：

相关酶活力的初步比较发现：高温诱导PK和LZM的高表达，暗示了其自身能量支出和非特异性免疫反应的增强。

图23　急性升温对相关酶活力的影响

2.5.2　慢性升温实验

（1）慢性升温条件下累计存活率变化：

对慢性升温实验下累计存活率进行统计发现：累计存活率曲线呈“阶梯状”，斜率的变化过程反映了褐牙鲆和杂交鲆对高温“不适应—调整—适应”的动态过程；29℃，30℃（0～72 h），32℃（96h）时，杂交鲆累计存活率显著高于褐牙鲆。

图24　慢性升温条件下累计存活率

对不同温度下的累计存活率分别进行统计发现，在29℃和32℃下，杂交鲆的存活率显著高于褐牙鲆。上图累计存活率中的30℃显著差异可能是由于时间上的累积效应造成的。因此，与杂交鲆相比，褐牙鲆可能对29℃、32℃更敏感。

图25　不同温度下的累计存活率

图26　慢性升温对鳃组织结构的影响

（2）慢性升温对鳃组织结构的影响：

对第二鳃弓进行石蜡切片比较组织变化发现：26℃，褐牙鲆出现上皮位移，杂交鲆出现水肿；28℃，褐牙鲆在上皮位移的基础上出现鳃丝融合，动脉瘤（出血），杂交鲆出现上皮位移和鳃丝融合；30℃，褐牙鲆出现严重的上皮位移，泌氯细胞破坏和鳃丝末端卷曲，杂交鲆出现上皮位移和鳃丝末端充血；32℃，褐牙鲆鳃丝上皮破坏严重，出现细胞破裂和坏死，鳃丝结构的破坏预示着呼吸功能的丧失，杂交鲆仅出现鳃丝末端卷曲充血，鳃的结构相对更完整。

总结慢性升温下鳃的相关症状，可以归纳为以下三个阶段，分别为轻度破坏、中度破坏和深度破坏。与褐牙鲆相比，杂交鲆鳃的相关症状出现得更晚更少，鳃的整体结构更完整。鳃结构的破坏和死亡率的爆发存在大致的对应关系。

表1　慢性升温下鳃的相关症状总结

（3）慢性升温对相关酶活力的影响：

与代谢及免相关的酶活力分析表明褐牙鲆肝脏的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）和丙酮酸激酶（PK）的相对活力比杂交鲆波动更显著，在28℃和31℃附近有显著升高，略微提前于死亡爆发（29℃，32℃）；褐牙鲆中酶活力的变化波动略微提前并与大量死亡爆发及组织学的变化基本一致。

图27　慢性升温对相关酶活力的影响

2.6　星斑川鲽、大菱鲆及其杂交后代线粒体DNA测序分析

2.6.1　实验材料及方法

2013年3月在日照市海洋水产资源增殖站育苗场，采用人工培育3龄星斑川鲽雌性亲鱼（平均体重均为1　750g）和3龄大菱鲆雄性亲鱼（平均体重2　400g），进行同步促熟培养；采用人工干法授精杂交，获得杂交受精卵并进行孵化培养。2013年7月采集平均体长为23 mm的杂交苗种肌肉及星斑川鲽和大菱鲆背鳍样本，分析所用星斑川鲽和大菱鲆成体包含人工杂交所用全部亲本，在95%酒精中固定以备提取基因组DNA（表2）。

表2　样品采集信息

（1）基因组DNA提取和PCR扩增：

取星斑川鲽、大菱鲆及其杂交后代样本肌肉组织100mg，采用标准的酚—氯仿方法提取基因组DNA，将提取的基因组DNA溶解于100μL双蒸水，4℃保存备用。用于扩增mtDNA　COI的引物分别为：COI-S　5′-GATCCAATCCTCTACCAACACC-3′和COI-R　5′-AGCAGCAACGATGGCAAAGACG-3′；mtDNA　D-loop的引物分别为：DL-S　5′-CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3′和DL-R　5′-TTCACCGAGTGAAACCCCCAC-3′［10］。PCR反应体系总体积为50μL，其中：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs　4μL（2.5mmol/L），引物各2 μL，Taq酶2U，模板DNA　2μL，加双蒸水至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后35个循环包括：94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min；最后在72℃延伸10 min。取2μL　PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（U＝5V/cm）。用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（上海华舜）进行目的片段的回收纯化。用ABI公司3700型全自动DNA序列分析仪进行双向测序，测序反应采用与PCR反应一致的引物。

（2）数据分析：

在系统发育研究中采用牙鲆（Paralichthys olivaceus，AB028664）作为外群进行了系统发育构建。

运用Dnastar软件包（DNASTAR，Inc.，Madison，USA）进行序列比对并辅以人工矫正。运用MEGA4.0计算序列的碱基组成、多态性、序列间的转换颠换比率［11］。并选择Kimura 2-parameter公式计算遗传距离。采用MEGA4.0软件，基于K-2P模型构建星斑川鲽、大菱鲆及其杂交子代线粒体COI基因片段和D-loop片段邻近关系树。

2.6.2　结果

（1）mtDNA　COI序列分析结果：

本研究所测定样品序列与GenBank中注册的星斑川鲽和大菱鲆的mtDNA　COI基因序列进行比对，确定所测序列为目的片段，所得目的片段长度皆为626bp。星斑川鲽不同样本碱基组成呈现一致性，平均为A：24.6%；T：30.7%；G：18.2%；C：26.5%。大菱鲆的碱基组成与星斑川鲽碱基组成略有不同，平均为A：23.6%；T：33.1%；G：18.7%；C：24.6%。星斑川鲽（♀）与大菱鲆（♂）杂交后代碱基组成与星斑川鲽碱基组成呈现一致性，平均为A：24.6%；T：30.7%；G：18.2%；C：26.5%，其与大菱鲆碱基组成存在差异。单倍型分析结果显示，在626bp长的片段上，星斑川鲽（40个）、大菱鲆（39）及其杂交子代（30）样本各共享一个单倍型，其中星斑川鲽和星斑川鲽♀×大菱鲆♂杂交后代各自所共享的单倍型为同一单倍型。

遗传分化结果显示，基于mtDNA　COI序列获得的星斑川鲽与大菱鲆种间遗传距离为22.9%，属于典型的科属水平的大分类阶元分化。星斑川鲽（♀）与大菱鲆（♂）杂交后代与大菱鲆的遗传分化显著，遗传距离达22.9%，而与星斑川鲽差异为种内遗传分化水平（表3）。基于邻近关系构建的系统发育结果显示，星斑川鲽♀×大菱鲆♂杂交后代与星斑川鲽聚为一支形成单系群，大菱鲆样本单独聚为一支（图28）。

表3　基于mtDNA　COI基因片段和D-loop序列的样品间遗传距离（下三角为COI结果，上三角为D-loop结果）

图28　样品线粒体控制区序列邻近关系系统发育树

（2）mtDNA D-loop序列分析结果：

通过对星斑川鲽、大菱鲆及其杂交子代序列比对分析，在449bp长的mtDNA　D-loop片段上检测到148个多态位点，其中转换位点67个，颠换位点72个，另外还检测到了10个碱基插入/缺失位点。在星斑川鲽mtDNA　D-loop片段上共检测到了4个多态位点，定义了3个单倍型，其碱基组成为A：33.1%；T：28.7%；G：15.8%；C：22.4%。大菱鲆40个样本共享一个单倍型，其碱基组成为A：33.3%；T：27.6%；G：16.1%；C：23.1%。在星斑川鲽（♀）与大菱鲆（♂）杂交后代mtDNA　D-loop片段上共检测到了3个多态位点，定义了2个单倍型，其碱基组成为A：33.1%；T：28.7%；G：15.8%；C：22.4%，与星斑川鲽碱基组成呈现一致性。

遗传分化结果显示，基于mtDNA　D-loop序列获得的星斑川鲽与大菱鲆种间遗传距离为41.2%，星斑川鲽（♀）与大菱鲆（♂）杂交后代与大菱鲆的遗传分化显著，遗传距离达41.2%，而与星斑川鲽差异仅为0.4%，为种内遗传分化水平。星斑川鲽样本间的遗传距离平均为0.3%，星斑川鲽（♀）与大菱鲆（♂）杂交后代样本间的遗传距离平均为0.4%。基于邻近关系构建的mtDNA　D-loop系统发育结果与基于mtDNA　COI序列获得的系统发育结果一致，星斑川鲽♀×大菱鲆♂杂交后代与星斑川鲽聚为一支，形成单系群，大菱鲆样本单独聚为一支。

2.7　大菱鲆vasa基因5′及3′侧翼序列染色体步移以及外源DNA转染大菱鲆精子研究

设计引物扩增大菱鲆vasacDNA5’UTR与起始密码子（ATG）之间的第一内含子序列，测序。根据内含子序列设计3条第一轮5′侧翼染色体步移引物，利用Genome　walking　kit提供的引物组合进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，克隆测序。根据测序结果设计3条第二轮5′侧翼染色体步移引物，进行PCR扩增，克隆测序。

根据大菱鲆vasa3’UTR序列设计3条3′侧翼染色体步移引物，进行PCR扩增，克隆测序。引物序列如下：

表4　大菱鲆vasa转录调控序列克隆引物

通过PCR扩增测序得到1129bp的第一内含子序列，序列5′端的GT和3′端的AG为典型的真核生物内含子序列（图29）。第一次5′侧翼延伸获得479bp片段，第二次5′侧翼延伸获得1　125bp片段，拼接后获得起始内含子上游序列2　733bp。3′侧翼延伸一次获得3.4 kb片段（图30）。

图29　大菱鲆5′侧翼染色体步移

M：DL2000Marker；阴影部分代表大菱鲆vasa　mRNA序列，斜体字母代表剪切位点

图30　染色体步移获得大菱鲆vasa基因调控序列

（岗位专家　李军）