同源四倍体水稻与狼尾草杂交结实的胚胎学证据

2023-11-28 理论教育版权反馈

【摘要】：试验结果为解释同源四倍体水稻与狼尾草杂交结籽的特殊生殖现象提供了有力的胚胎学证据。关键词同源四倍体水稻;狼尾草;远缘杂交;结实;胚胎学证据植物育种的历史已经证实，育种新材料的发现和创造将会使育种水平得到进一步的提高。本文报道在以同源四倍体水稻为母本与狼尾草的杂交中，利用激光扫描共聚焦显微技术寻找其胚胎学证据的实验结果。

同源四倍体水稻与狼尾草杂交结实的胚胎学证据⁽¹⁾

黄群策　梁秋霞

摘要　在以6份同源四倍体水稻为杂交母本与狼尾草进行属间杂交中发现，其结实率达到0.84%～2.06%，而在以二倍体水稻为母本的属间杂交中却没有获得结实种子。利用激光扫描共聚焦显微技术对属间杂交结籽的特殊生殖现象进行了观察研究，试图寻找其杂交结实的胚胎学证据。结果表明，狼尾草的花粉粒不能在二倍体水稻的柱头上萌发，说明二倍体水稻与狼尾草的生殖隔离很严格，两者很难杂交。然而，狼尾草的花粉粒在同源四倍体水稻的柱头上能萌发，花粉管能在花柱中伸长并能将雄配子送入胚囊内与雌配子融合成受精卵。同源四倍体水稻与狼尾草的受精作用比较特殊，包括精细胞与卵细胞的单受精作用、精细胞与次生极核的单受精作用和正常的双受精作用，总受精率和总成胚率分别为6.36%～11.68%和4.11%～9.44%。试验结果为解释同源四倍体水稻与狼尾草杂交结籽的特殊生殖现象提供了有力的胚胎学证据。

关键词　同源四倍体水稻;狼尾草;远缘杂交;结实;胚胎学证据

植物育种的历史已经证实，育种新材料的发现和创造将会使育种水平得到进一步的提高。近几年来，我国水稻育种未能取得实质性的突破，其主要原因就是可供水稻育种家利用的优良种质资源不足，亲本材料在遗传上的亲缘混杂现象比较严重，在现有的水稻育种基础上试图获得更优良基因型进而提高产量潜力的几率很小。为了改变水稻育种的现状，迫切需要采取有效的措施和寻找育种新方法从远缘物种中引进优良的基因资源，对水稻材料进行有效地改造，从而创造出具有特别重要意义的水稻新种质。然而，在水稻育种上利用远缘杂交方式创造水稻新种质的难度比较大，首先需要解决的问题就是要打破远缘物种之间的生殖隔离，克服其不可交配性。自从1963年以来，一些研究者根据狼尾草(Pennisetum alopecuroides，2n=2x=18)具有生长势旺盛、穗大粒多、再生能力和宿根能力强、抗多种病虫、耐旱耐瘠等优良特性，试图通过二倍体水稻与狼尾草之间的远缘杂交方式将狼尾草的优良性状引入到水稻中，进而创造出具有特殊意义的水稻新种质。然而，在二倍体水稻与狼尾草之间的远缘杂交中生殖隔离相当严重，杂交很难成功^［1－2］。近年来，在对多倍体水稻的研究中发现，其生殖性状比较特殊，有性生殖能力比较弱^［3－5］。在利用同源四倍体水稻为母本与假稻的杂交中获得了充实度达到正常水平的杂交种子^［6］;在同源四倍体水稻为母本与狼尾草的杂交中也获得了类似的结果^［7］。对于这种在以二倍体水稻为母本的属间杂交中难以见到的异交现象值得进一步研究。本文报道在以同源四倍体水稻为母本与狼尾草的杂交中，利用激光扫描共聚焦显微技术寻找其胚胎学证据的实验结果。

1　材料与方法

1.1　试验材料和杂交配组

2002年以6份同源四倍体水稻材料Ce47₍₄₎［试验材料的下标(4)和(2)分别代表同源四倍体水稻和二倍体水稻］、Ce48₍₄₎、Ce49₍₄₎、Ce64₍₄₎、Ce90₍₄₎、Gui97₍₄₎和相应的二倍体水稻材料Ce47₍₂₎、Ce48₍₂₎、Ce49₍₂₎、Ce64₍₂₎、Ce90₍₂₎、Gui97₍₂₎为母本，以狼尾草为花粉供体进行杂交配组。在授粉的前1 d对母本的稻穗按常规方法进行修整，保留第2天将开花的颖花，并采用人工剪颖法对其进行去雄。每份材料去雄84个稻穗，在每个稻穗上保留25～35朵去雄颖花，去雄后套袋隔离以防串粉。在去雄后的第2天上午向每份母本材料的80个去雄稻穗的颖花内投入新鲜的狼尾草花粉粒进行人工授粉，每份母本材料保留4个去雄稻穗不予授粉作为对照。

1.2　材料固定和胚胎学观察

授粉后，按照7个时间段进行材料固定，即在授粉后30min、1h、6h、24h、48h、72h和96h，分别从每份母本材料中取10个授粉稻穗(每份材料共计70个授粉稻穗)，将其标记后固定在FAA溶液中，在4条件下保存备用。

首先将固定在FAA溶液中的颖花取出，剥出其中的子房，在室温条件(25℃)下分别用体积分数为70%、85%和95%的乙醇对子房进行梯度脱水，在每1梯度乙醇中的浸泡时间为20min。随后，将子房放入无水乙醇中浸泡2次，每次浸泡时间为2h，再转入无水乙醇中过夜。第2天将已经脱水的子房放入由无水乙醇和冬青油(1∶1)组成的混合溶液中过渡1h，再用冬青油清洗3次，在前两次清洗时每次浸泡2h，第3次浸泡15h。所有的试验材料经过冬青油透明处理后可以留在冬青油中保存备用。

试验材料经过预处理之后，再利用激光扫描共聚焦显微技术进行观察鉴定，以确定授粉后子房内部的形态特征和受精作用。首先将保存在冬青油中的子房放置在一张凹玻片的中央，加一滴冬青油，盖上盖玻片，再用指甲油封片。随后，在激光扫描共聚焦显微镜(BioRadmRC600 CLSM)下对每份材料的子房内部结构特征进行观察、分析、比较和鉴定。

1.3　杂交效果观察

让每份母本材料余下的10个授粉稻穗和4个对照稻穗自然发育，在授粉后10 d观察和统计各授粉颖花内子房膨大的状况，授粉后30 d观察和统计各授粉颖花的结实情况。在观察中发现，有一些颖花内的籽粒充实度达到正常水平，而在另一些颖花内籽粒的充实度只达到50%左右，其内包含有乳白色的淀粉，这些颖花均统计为结实颖花。

2　观察结果及其分析

2.1　同源四倍体水稻与狼尾草杂交的效果

对试验中进行了人工去雄而没有进行授粉的各个颖花的考查结果表明，本试验中的去雄工作彻底，套袋隔离严格，没有发现自交结实现象。在以二倍体水稻为母本与狼尾草杂交的6个组合中，授粉后10 d发现，有一部分颖花内的子房(2.88%～9.30%)在狼尾草花粉粒的刺激下发生膨大。然而，在授粉后30 d的考查结果表明，在6个杂交组合中没有发现结实颖花，原来发生膨大的子房在此时表现为干瘪状，其内不包含淀粉。由此可见，二倍体水稻与狼尾草的生殖隔离很严格，两者之间的杂交很难成功。这些结果与前人获得的结果相似^［1－2］。

在同源四倍体水稻为母本与狼尾草杂交的6个组合中，授粉后10 d发现，有很多颖花内的子房(44.35%～71.82%)在狼尾草花粉的刺激下发生膨大。授粉后30 d的考查结果表明，在6个杂交组合中发现了正常结实的颖花，其结实率达到0.84%～2.06%(表1)。在结实的颖花中，大部分籽粒的充实度达到正常水平，只有少数籽粒充实得不很饱满。由此可见，在以同源四倍体水稻为母本与狼尾草的属间杂交中存在一定的可交配性，两者的生殖隔离不是很严格，杂交成功的几率较大。这些结果与我们在以同源四倍体水稻为母本与假稻(Leersiahex－andra)杂交中所获得的结果相似^［6］，也进一步验证了我们以前在这方面所做的工作^［7］。

表1　水稻×狼尾草杂交结果

(www.chuimin.cn)

3.2　花粉粒萌发和花粉管伸长状况

在以二倍体水稻为母本与狼尾草杂交的6个组合中发现，授粉后狼尾草的新鲜花粉粒不能在二倍体水稻的柱头上萌发。在授粉后24h，狼尾草的花粉粒在二倍体水稻的柱头上均没有萌动，更没有伸出花粉管，并且，在二倍体水稻的花柱内也没有观察到花粉管。可见，二倍体水稻不能与狼尾草进行属间有性杂交的生殖障碍首先表现在狼尾草的花粉粒在二倍体水稻的柱头上不能萌发。此观察结果与我们在进行杂交配组时所得到的结果(即不能获得杂交种子)相吻合。

在同源四倍体水稻与狼尾草杂交的6个组合中所得到的观察结果则比较复杂。在授粉后30min固定的颖花中发现，每朵颖花的柱头上都沾满狼尾草的花粉粒，其中，在部分颖花的柱头上观察到正在萌发的花粉粒，其花粉管正伸入柱头内，但尚未伸入到花柱内。在授粉后1h固定的颖花中，有部分颖花的花柱内发现了正在伸长的花粉管。在授粉后6h固定的颖花中，在一些颖花胚囊内的珠孔端发现了花粉管进入胚囊时所留下的痕迹。这些观察结果说明，同源四倍体水稻与狼尾草的生殖隔离不很严格，后者的花粉粒在前者的柱头上可以萌发，花粉管可以在花柱内伸长，直至进入胚囊之内。

2.3　属间杂交中的受精作用

在试验中观察到，狼尾草的花粉管进入同源四倍体水稻的胚囊后，2个精子被释放到卵细胞外的合点端。在授粉后1 d固定的一些子房中，可以看到卵细胞中出现了雄性核仁，这说明同源四倍体水稻的卵细胞与狼尾草的精细胞发生了两性融合。对授粉后2 d、3 d和4 d的子房分别进行观察鉴定的结果表明，在同源四倍体水稻与狼尾草的杂交中存在精细胞与卵细胞的单受精现象、精细胞与次生极核的单受精现象和正常的双受精现象。统计结果表明，总受精率高达6.36%～11.68%，总成胚率高达4.11%～9.44%。这一观察结果与我们在杂交试验中所得到的结果相吻合。

3　讨论

关于创造水稻新种质的探索性研究，很早就引起了水稻研究者们的重视。自从20世纪60年代以来，许多研究者试图将野生植物中的有益性状引入到水稻中，进而创造出水稻新种质，但成效并不明显。值得特别指出的是，过去的研究者在进行水稻的远缘杂交时忽视了一个重要问题，即二倍体水稻具有比较强的有性生殖能力，二倍体水稻在远缘杂交中会表现出严格的生殖隔离现象，由此导致远缘杂交的效率相当低或杂交难以获得成功。然而，近年来，我们在研究同源四倍体水稻的生殖特性时发现，同源四倍体水稻具有比较特殊的生殖性状，其有性生殖能力比较弱，遗传可塑性比较大，在雌雄配子和雌雄配子体的发育过程中存在着明显的多态性^［4－5］。根据同源四倍体水稻的生殖特性，我们在以创造水稻新种质为目的的远缘杂交中以其作为母本分别与狼尾草和假稻杂交均获得了比较好的效果^［6－7］。

本试验的观察结果表明，在以同源四倍体水稻为母本的杂交试验中，远缘物种间具有一定的可交配性，获得了充实度达到正常水平的实粒种子。狼尾草的新鲜花粉粒在二倍体水稻的柱头上不能萌发，更不能产生花粉管，这种生殖隔离属于配子体型的生殖隔离。相反，狼尾草的新鲜花粉粒在同源四倍体水稻的柱头上可以萌发，进而能产生花粉管，花粉管能深入母本的花柱中并将两枚精子送入胚囊内，发生受精作用。值得指出的是，在以同源四倍体水稻为母本的属间杂交试验中，受精作用比较特殊，其中包括精细胞与卵细胞的单受精现象、精细胞与次生极核的单受精现象和正常的双受精现象。不管受精作用是多么的特殊，在其中毕竟能形成一些具有生活力的合子和初生胚乳核，受精率和成胚率分别高达6.36%～11.68%和4.11%～9.44%，说明同源四倍体水稻与狼尾草之间的生殖隔离并不很严格，两者之间存在着一定的可交配性。我们认为，同源四倍体水稻在水稻的远缘杂交中是一种很好的亲本和桥梁，以其为中介，可望将远缘物种中的有益基因引入到二倍体水稻中，进而创造出具有实用价值的水稻新种质。

参考文献

［1］吴素萱，蔡启贵．水稻与狼尾草杂种F0的细胞学观察［J］．植物学报，1963，11(2):293－301．

［2］王敬驹，孙敬三．水稻与狼尾草杂种的细胞学研究［J］．植物学报，1981，23(1):104－109．

［3］黄群策，孙敬三．通过异倍性水稻间杂交获得同源三倍体植株［J］．植物学报，1999，41(7):741－746．

［4］黄群策，孙敬三．同源四倍体水稻的生殖特性研究［J］．中国农业科学，1999，32(2):14－17．

［5］黄群策，孙敬三．同源四倍体水稻雌雄配子体多态性的研究［J］．杂交水稻，1999，14(1):32－35．

［6］黄群策．同源四倍体水稻与假稻杂交获得实粒种子［J］．作物学报，2001，27(1):135－137．

［7］黄群策．同源四倍体水稻与狼尾草杂交的效果［J］．中国水稻科学，2000，14(1):48－50．

【注释】

(1)该文曾在《杂交水稻》［2004，19(1):56～59］刊出