水稻染色体组多倍化研究实现同源三倍体植株间杂交

通过异倍性水稻间杂交获得同源三倍体植株⁽¹⁾

黄群策　孙敬三

摘要　以3个二倍体水稻(Oryza sativa L.)(2n=2x=24)和3个同源四倍体水稻(2n=4x=48)为杂交亲本配制6个自交组合和30个杂交组合。试验结果表明，同源四倍体组合的结实率比较低(10.01%～21.78%)，这可能与其花药内所包含的正常花粉粒比例小而异常花粉粒比例大有关。异倍性杂交组合的结实率更低(0.20%～1.64%)，但在两种配组方式之间却存在着明显差异，即以同源四倍体水稻为杂交母本而以二倍体水稻为杂交父本则其异交结实率比较高(0.42%～1.64%)，反之，以二倍体水稻为杂交母本而以同源四倍体水稻为杂交父本则其异交结实率比较低(0.20%～0.85%)。在杂交时重复一次授粉能显著地增加多倍体组合的异交结实种子数。除此之外，对APⅣ₍₄₎×APⅣ₍₂₎杂交组合的胚胎学观察结果表明，其受精率比较低(34.2%)，其中包括卵细胞的单受精(25.0%)、中央细胞的单受精(3.3%)以及卵细胞和中央细胞的双受精(5.9%)。

关键词　异倍性水稻;受精率;子房培养;三倍体植株

随着远缘植物之间杂交亲和性问题的细胞胚胎学和生物化学的研究进展以及离体组织培养技术的不断完善，已经大幅度地提高了植物远缘杂交工作的效率并扩大了杂交的范围^［1，2］。在植物远缘杂交中，双亲之间亲缘关系的远近一般决定着其杂交的难易程度。然而，在普通栽培稻中不同倍性的材料间相互杂交的可交配性是否也遵循这一规律是值得研究的问题。关于利用二倍体水稻与其同源四倍体水稻通过有性杂交来获得同源三倍体水稻的研究尚未见到公开报道。通过培育无融合生殖水稻来固定水稻的杂种优势是水稻育种工作者追求的战略性目标。在被子植物中无融合生殖与多倍性之间存在着明显的正相关关系，即在二倍体植物中无融合生殖现象甚为罕见，而表现无融合生殖特性的植物大部分具有多倍性^［3］。因此，试图从二倍体水稻中挖掘出无融合生殖基因难度较大，而通过培育同源三倍体水稻则有可能从中寻找到潜在的无融合生殖基因，这将为水稻无融合生殖研究开辟一条值得进一步探索的新途径^［4，5］。

1　材料和方法

以3份二倍体水稻(Oryza sativa L.)APⅣ₍₂₎、IR36₍₂₎、紫血稻₍₂₎和3份同源四倍体水稻APⅣ₍₄₎、IR36₍₄₎、紫血稻₍₄₎为杂交亲本^［5］，按照完全双列杂交方式配制6个自交组合和30个杂交组合，其中包括9个二倍体组合，9个四倍体组合和18个异倍体组合。在进行杂交配组过程中，除了对3个二倍体自交组合和3个四倍体自交组合不进行人工去雄，只用羊皮纸袋在开花前1 d对已修剪的稻穗进行套袋隔离后让其进行自交之外，其余30个杂交组合均在母本开花前2 d进行严格的人工剪颖去雄。每一个组合去雄22个稻穗，每个稻穗剪颖去雄30～60个颖花，用羊皮纸袋对已去雄稻穗进行套袋隔离。对每一个杂交组合，除保留2个去雄稻穗不进行人工授粉以作为检验去雄效果的对照之外，其余20个去雄稻穗均全部接受相应父本的花粉，授粉后继续套袋隔离。授粉方式做2种处理，即一次授粉(在去雄后第二天对每一个杂交组合的母本稻穗仅进行1次授粉)和二次授粉(在进行第一次授粉后在第二天再次授粉1次)。对每一个杂交组合，每一种处理包括10个去雄稻穗。在授粉后9～10 d对每一母本材料的子房膨大状况进行考查和统计。在授粉后20 d统计每一组合的异交结实率。在APⅣ₍₄₎×APⅣ₍₂₎杂交组合授粉后30min、2 d、4 d和6 d分别从一次授粉材料中取40个颖花用FAA溶液固定，在4℃条件下保存备用。根据子房整体染色法和常规石蜡切片技术^［6］，在显微镜下镜检，对其胚囊发育状况进行观察分析。

在试验中以两个杂交组合APⅣ₍₄₎×APⅣ₍₂₎和IR36₍₄₎×IR36₍₂₎的杂种幼胚为拯救对象，以APⅣ₍₄₎的自交幼胚为对照。试验中采用MS培养基对子房进行培养。采用剪颖去雄法将颖花去雄后套袋隔离。第二天上午进行人工授粉或让其自交。在授粉后或开花后4h将一部分稻穗放入浓度为10×10^－6的2，4－D溶液中浸泡10min，第二天对这些稻穗再浸10min;试验中的另外一部分稻穗则不放入2，4－D溶液中浸泡而只在蒸馏水中浸泡10min以作为对照。授粉后或开花后7 d在超净工作台上将颖壳内膨大子房剥出后放入水中。随后，用干滤纸吸干水后再用70%酒精作表面消毒1min，转入0.1%升汞溶液中灭菌15min，用无菌蒸馏水洗涤4次后接种在MS固体培养基上进行子房培养。培养室温度为25℃±1℃，光照时间为8h。在培养期间，观察记录子房的形态变化和颜色变化。出苗后对植株的不定根根尖细胞染色体数目进行压片镜检，确定三倍体植株数目。

除此之外，对试验中所采用的6份杂交亲本的花粉粒育性进行了考查，即从每一个杂交亲本中取10个已成熟颖花，挑出其中60个花药，用0.1% I₂－KI溶液轻轻研磨后悬浮液定容至200mL，随后，取2mL等份悬浮液，抽滤制膜，在显微镜下根据花粉粒的形态和染色状况统计败育花粉粒数目和正常花粉粒数目。每张膜观察4个视野。

2　实验结果

2.1　杂交亲本的花粉粒育性

观察结果表明，二倍体杂交亲本具有正常的花药(其长度为2.8～3.2mm)，每枚花药膨松饱满，呈鲜黄色，其中所包含的花粉粒84%以上为正常花粉粒，染败花粉仅为9.22%～15.79%，没有镜检到典败花粉粒和圆败花粉粒，在每枚花药内包含的花粉粒大为608～822粒。四倍体杂交亲本的花药类似于某些红莲型雄性不育系的花药，其外形干瘪瘦小，呈浅黄色，但前者的花药比较大(其长度为4.6～5.1mm)，其内包含有典败花粉粒(16.49%～19.66%)、圆败花粉粒(25.49%～27.57%)、染败花粉粒(36.21%～41.51%)和正常花粉粒(13.35%～17.49%)。在每枚花药内包含的花粉粒为412～486粒。从花粉粒的外形来看，正常的四倍体花粉粒要比正常的二倍体花粉粒大1/4～1/ 5。由此可见，在同源四倍体水稻花药内包含的正常花粉粒比较少，而败育花粉粒比较多，这可能是其结实性比较差的主要原因之一。

2.2　不同组合的结实性比较

在9个二倍体组合中，结实率达到了比较高的水平(69.43%～83.34%);在一次授粉和二次授粉之间，异交结实率并没有表现出明显的差异。在9个四倍体组合中，结实率均比较低(10.01%～32.51%)，但是，在一次授粉和二次授粉条件下，各自的异交结实率有明显差异，二次授粉对于提高四倍体组合的异交结实率似乎有明显的促进作用。在18个异倍体组合中，各组合的异交结实率均相当低(0.20%～1.64%)，其中，以四倍体为杂交母本，二倍体为杂交父本的9个杂交组合在一次授粉条件下其异交结实率的变幅为0.42%～0.99%，在二次授粉条件下则为0.87%～1.64%。与此相对应的9个反交组合(即以四倍体为杂交父本)表现出更低的异交结实率(在一次授粉条件下为0.20%～0.50%，而在二次授粉条件下则为0.47～0.85%)。由此可见，在异倍性水稻之间具有一定的可交配性，通过有性杂交能获得结实种子;同源异倍体组合的杂交结实率很低，但在杂交亲本的不同组配方式与其异交结实率的高低之间有一定的相关性，即在进行杂交配组时以四倍体为杂交母本而以二倍体为杂交父本进行配组则其异交结实率比较高，反之，以二倍体为杂交母本而以四倍体为杂交父本进行配组则其异交结实率比较低。除此之外，在进行杂交时重复一次授粉有利于提高多倍体组合的异交结实率。

2.3　子房膨大状况与实粒数

在9个二倍体组合中，授粉后所观察到的子房膨大数与实粒数完全相同，而且籽粒的充实度均达到正常水平。在四倍体组合和异倍体组合中，授粉后所观察到的子房膨大数与实粒数之间存在着明显的差异，即子房膨大数明显地多于结实数，这表明在授粉之后有一部分子房(或幼胚)不能像正常二倍体水稻那样按照正常的发育途径生长发育，结果在发育的中途夭折，这也是多倍体组合异交结实率比较低的主要原因之一。

前人的研究结果表明，正常的二倍体水稻在受精次日起子房开始纵向伸长，3 d后达到米粒全长的1/2。在本试验中发现，无论是四倍体组合还是异倍体组合，授粉后子房膨大的时间推迟并出现部分异常子房。有两种类型的异常子房在发生膨大后又会发生退化:其一是在授粉后6～7 d子房才明显膨大，到授粉后10 d达到最大(相当于颖壳内容积的1/15～1/20)，随后会停止发育，在其内部不存在乳白色的淀粉液而只有透明的水溶液。其二是在授粉后4～5 d子房才明显膨大，并像正常二倍体水稻那样沿着内颖产生弯月形的胚乳，在授粉后10 d达到最大(相当于颖壳容积的1/10～1/15)，随后停止发育，在其内包含有乳白色的稀淀粉液。依此推测，第一种类型很可能是有胚而无胚乳或在花粉刺激下引起的单纯性子房壁膨大的结果，第二种类型很可能是无胚而有胚乳的结果，其根源就是在授粉后发生了异常的双受精作用。

2.4　胚胎学观察结果

对APⅣ₍₄₎×APⅣ₍₂₎杂交组合授粉后材料的胚囊进行观察的结果表明，APⅣ₍₂₎的花粉粒能在APⅣ₍₄₎的柱头上萌发，前者的花粉管能在后者的花柱内伸长并到达珠孔(图1，A)，但花粉粒的萌发和花粉管在柱头内的伸长速度似乎比较慢，在开花后2 d所固定的材料中，发现5个花柱(12.5%)内有花粉管长入而此时在胚囊内卵细胞和中央细胞均未受精。这种以四倍体为母本而以二倍体为父本所配制的杂交组合，其受精率比较低，其中包括卵细胞单受精、中央细胞单受精以及卵细胞和中央细胞的双受精(图1，B、C、D、E)，这一观察结果与杂交试验中所得到的结果相符。在观察中还发现，受精后合子和初生胚乳核的发育速度比较慢，由此导致某些合子在发育中途退化，胚乳发育不正常而导致谷粒的充实度下降。

图1(www.chuimin.cn)

2.5　通过子房培养拯救杂种幼胚的效果

在本试验中，在18个异倍性杂交组合中一共去雄和授粉的颖花数为17 202粒，收获实粒种子139粒，萌动种子92粒，成活植株32株。在试验中经过对32株成活植株的不定根根尖细胞染色体数进行检查后确定，其中只有7个杂交组合的12株是同源三倍体植株(2n =36)，而另外20株都是二倍体植株(2n=24)。由此可见，通过异倍性水稻间相互杂交获得同源三倍体成活植株的频率相当低(0.07%)。

在进行杂种子房培养时，在异倍性杂交组合的配组中去雄和授粉的颖花数为3 465枚，由此获得膨大子房数为315个，出苗数为47株，成苗数为38株，经过根尖细胞内染色体鉴定后确定，其中所包含的同源三倍体成活植株数为27株(图1，F、G、H)。因此，通过子房培养法所获得的同源三倍体成活植株的效率为0.78%，这比通过常规杂交法来获得种子，进而获得同源三倍体成活植株的效率(0.07%)要高出11.14倍。

3　讨论

3.1　异倍体水稻杂交异交结实率低的可能原因

利用异倍性水稻杂交获得三倍体水稻的结实率问题，目前尚未见报道。20世纪80年代初，利用二倍体高粱与同源四倍体高粱进行相互杂交很难获得三倍体杂交种子^［2］。我们认为，由二倍体水稻与四倍体水稻进行正反交配组时其异交结实率低的原因包括遗传因素、雌雄生殖器官的形态差异和生理生化因素等，其中遗传因素起主导作用。二倍体水稻与相应的四倍体水稻，由于各自染色体组的倍性差异而导致一系列的形态差异和生理生化代谢上的差异，因而两者在分类学上被有些学者视为不同的物种^［7］。在二倍体水稻的两个相同的染色体组，经过长期的进化过程，遗传上已经达到平衡，各种生理生化活动均能顺利进行，因此其结实率可保持正常水平。当染色体组成倍增加之后，其细胞核与细胞质的比例关系发生变化，各染色体在减数分裂过程中有可能发生不均衡分配、基因的剂量效应和基因的互作效应等都会破坏原有的生理生化功能的平衡。致使四倍体水稻的正常花粉粒数很少，而败育花粉粒很多，利用四倍体水稻为杂交父本与二倍体水稻杂交时其异交结实率明显地低于相应的反交组合。

3.2　提高异倍性水稻杂交结实率的可能措施

一般而言，物种之间的可杂交性是指分类上属于不同类群的个体之间相互杂交后可以产生成熟种子或胚芽，由此得到F₁植株的潜能，因此，物种之间的可杂交性可以用四种不同的杂交亲和性来表示，即正反交完全亲和或几乎完全亲和、单侧不亲和、部分杂交成功但必须借助于胚培养和完全不亲和。本试验的研究结果表明，二倍体水稻和四倍体水稻虽然被视为不同的物种，但两者之间的生理隔离并不很严格，正反交配组方式均能获得结实种子，只是异交结实率很低，这一问题有待于解决。我们认为，至少有3条技术措施可以用来提高异倍性水稻之间的异交结实率。其一是采用合理的组配方式:在柑橘的三倍体育种中，2个三倍体品种“Melogold”和“Oroblanco”是来自2×(♀)×4×(♂)的杂交育种计划^［8，9］．但是，由于二倍体水稻的正常花粉粒数明显地多于四倍体水稻的正常花粉粒数，因而以四倍体水稻为杂交母本而以二倍体水稻为杂交父本则有可能获得比较多的结实种子。其二是重复授粉:在禾本科作物的远缘杂交中，利用重复授粉来克服杂交不亲和性的方法已经得到肯定。据推测，第一次授粉虽然表现出不亲和，但有可能活化了柱头，使第二次授粉的受精率提高^［1，2］。根据我们的观察，在进行异倍性水稻杂交时，在开花当天和第二天分别进行授粉其效果比较好，但第三天再次授粉则没有表现出明显的效果。其三是对杂种胚进行离体培养:在试验中发现，授粉后的子房膨大数明显地多于最后的结实数，其中有相当一部分幼胚可能是由于缺乏胚乳或胚乳发育不正常，而导致胚的败育所造成。如果在杂种幼胚发育早期采用离体培养方法进行幼胚拯救则有可能阻止某些杂种胚的解体，因而能获得更多的杂种个体。通过杂种子房培养来拯救杂种幼胚的试验结果表明，同源三倍体成活植株的获得率(0.78%)仍然比较低，但比通过常规杂交法首先获得种子，进而获得同源三倍体成活植株的效率(0.07%)要高出11.14倍。

参考文献

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［9］Soost R K，Cameron J W.Melogold，a triploid pummelograpefruithybrid［J］.Hort Sci，1985，29: 1134－1135．

【注释】

(1)该文曾在《植物学报》 ［1999，41(7):741～746］刊出