离子注入后水稻无性系突变及染色体组多倍化状况研究

离子注入后双胚苗突变水稻的无性系诱导⁽¹⁾

黄雅琴　黄群策　赵帅鹏

摘要　以离子注入后同源四倍体双胚苗突变水稻及其衍生后代为研究材料，利用无性系诱导技术对愈伤组织的脱分化和再分化特性进行了初步研究研究结果表明，同源四倍体水稻与相应的二倍体水稻在无性系诱导中存在着明显的差异;在试验中将2，4－D浓度由2.0mg/l提高到2.5mg/l则可以获得比较高的诱导率;半胚乳处理不但能提高愈伤组织的诱导率，也能提高愈伤组织的质量，干燥处理能提高愈伤组织的分化率。

关键词　离子注入;同源四倍体水稻;双胚苗;无性系诱导

杂交水稻育种从研究方法上可以分为三系法、两系法和一系法这3个发展阶段;从利用水稻杂种优势的水平上可以分为品种间杂种优势利用、亚种间杂种优势利用和远缘杂种优势利用这3个发展阶段^［1］。一系法杂交水稻研究的实质就是挖掘具有特殊生物学意义的种质资源和建立特定的技术程序，以便固定水稻的杂种优势，前人的研究结果表明，在禾本科植物中，多胚现象或多胚苗现象是无融合生殖物种在胚胎学和形态学上的重要特征，因而通过筛选多胚苗材料，进而寻找无融合生殖种质是一条比较有效的研究途径^［2］。我国水稻无融合生殖的研究重点主要是筛选多胚苗水稻新种质和对多胚现象的特异性进行研究，试图以此寻找无融合生殖基因，然而，前人的研究并没有取得突破性进展^［3］。基于目前的研究现状，黄群策^［4］提出了在多倍体水平挖掘水稻潜在利用价值的技术策略20世纪80年代中期发展起来的离子束生物技术具有独特的技术原理和简单的操作程序，它在作物育种中的实用性已经被越来越多的研究结果所证实^［5］。黄群策等^［6］以低能氮离子束为诱变源对同源四倍体水稻进行了遗传改良，在其后代群体内筛选到具有双胚苗特征的新材料为了对同源四倍体双胚苗突变水稻进行有效的遗传改良，郑州大学离子束生物工程河南省重点实验室的研究人员利用无性系诱导技术对其脱分化和再分化特性进行了初步研究，试图为在细胞工程水平研究同源四倍体水稻双胚苗材料的细胞学特性提供技术资料。

1　材料与方法

1.1试验材料

同源四倍体双胚苗突变水稻材料D07－04－01，其近亲系D07－02－01和01－04－01，以及介导品系DP07－04－01、D07－02－01是以D07－04－01的花粉材料通过花药培养途径所获得的稳定的二倍体后代株系; 01－04－01是D07－04－01的四倍体原始亲本，由它通过离子注入后筛选到具有双胚苗特征的材料;以D07－04－01为受体，披碱草总DNA为供体在离子束的介导下转基因，在后代群体内筛选到四倍体突变单株DP07－04－01。

1.2　试验方法

1.2.1　愈伤组织的诱导

挑选籽粒饱满的成熟种子，剥去颖壳，用70%(V∶V)酒精消毒90s，无菌水冲洗3次，

再用0.1%(V∶V)升汞消毒15min，无菌水冲洗5次，然后接种于诱导培养基表面，置于25℃培养箱进行暗培养21 d后统计愈伤组织诱导率并观察记录愈伤组织质量状况挑选颗粒状的干爽胚性愈伤组织转移至新鲜诱导培养基进行继代，25条件下继续暗培养，进行继代增殖。

1.2.2　愈伤组织的分化

从继代10 d左右的愈伤组织中挑选出淡黄色、结构致密、颗粒状、表面光滑、生长旺盛的胚性愈伤组织无菌接种于分化培养基，25℃光照培养，光照强度2 000～2 400 lx，每天光照12h进行分化30 d后统计愈伤组织的分化率。

1.2.3　炼苗，移栽，培养

分化小苗长至6cm高后，揭去培养瓶盖，往培养瓶中加入少量水，在室温下炼苗两

天，移栽入花盆，于实验室露天平台培养，即得到生长健壮且根须发达的水稻再生植株。

1.2.4数据统计

成熟胚愈伤组织诱导率=×100%;

成熟胚绿苗分化率=×100%;

所有试验数据均使用数据统计分析软件进行处理。

2　结果与分析

2.1　不同的基因型对愈伤组织诱导率的影响

以MS +2.0mg/L 2，4－D +30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂为基本的诱导培养基进行愈伤组织的诱导，各品种全胚乳种子在培养4～5 d后开始长出胚芽，然后在7～9 d左右开始陆续从胚芽鞘基部长出淡黄色鲜嫩愈伤组织，于第21天统计诱导率。D07－02－01的诱导率最高(91.7%)，D07－04－01、01－04－01和DP07－04－01的诱导率分别为70．4%、68.9%、80.3%。试验结果表明，当2，4－D浓度在2.0mg/L时，D07－02－01表现出较高的诱导率，而其他3个四倍体材料的诱导率与之相比均较低。DPO7－04－01的诱导率高于双胚苗亲本9.9%，这可能是由于外源遗传物质的导入形成了新的基因组平衡，并对原有的激素水平进行了调节，从而促使种胚细胞更容易脱分化形成愈伤组织。D07－04－01与01－04－01相比，诱导率仅高1.5%，这一细微差别可能是由于

接受了离子束辐照，带正电荷离子的植入产生了特有的生物学效应，这一效应产生的机制还有待进一步研究由此可见，以相同的诱导培养基诱导愈伤组织，基因型的不同造成了诱导率的差异。

2.2　不同浓度的2，4－D对愈伤组织的诱导率的影响(www.chuimin.cn)

以MS +30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂为基本的诱导培养基，分别附加2.0mg/L 2，4－D、2.5mg/L 2，4－D、3.0mg/L 2，4－D对4个不同品种的全胚乳种子进行愈伤组织的诱导。试验结果如表1所示，当2，4－D浓度为2．0mg/L时，D07－02－01的愈伤组织诱导率最高，而其他3个品种诱导率较低，同时还出现了种子直接长出幼苗和根的现象，这对诱导率造成了影响，成功诱导出来的愈伤组织呈浅黄色，干爽，紧致，胚性较好;当2，4－D浓度为2．5mg/L时，4个品种均达到了较高的诱导率，只出现极少数的长绒毛状须根和长苗的现象，同时愈伤组织生长速度也较稳定，愈伤组织的质量也较好;当2，4－D浓度为3．0mg/L时，4个品种的诱导率都有一定的下降，除01－04－01外，其他3个都有出现少数的绒毛状须根，其中以D07－02－01长须根率最高，达0.3%，DP07－04－01其次，达0.2%。在此2，4－D浓度条件下均未发现种子长出幼苗，成功诱导出来的愈伤组织颗粒状、松散、一部分呈浅黄色，一部分呈深黄色，生长力较弱。由此可见，最适的2，4－D浓度因基因型的不同而有所差异，对于二倍体水稻而言，2.0mg/L 2，4－D能够达到较高的诱导率并且愈伤组织质量好，对于四倍体水稻而言，只有提高2，4－D的浓度才能满足要求，不同的四倍体水稻在不同的2，4－D浓度下愈伤组织的诱导效果也不相同，D－07－04－01和01－04－01在浓度为2.5mg/L时效果最佳，而DP07－04－01在浓度为2.5mg/L时有较高的诱导率，但却出现了长绒毛状须根和幼苗的现象，在浓度为3.0mg/L时长幼苗的现象虽然消失了，但诱导率却下降了7.7%，针对这一介导品系的特殊性，可以考虑在诱导培养基中与细胞分裂素配合使用，以求达到理想的诱导效果。总之，2，4－D浓度的选择因不同的基因型而异。

表1　不同尝试的2，4－D对愈伤组织的诱导效果

注: A代表长出正常的胚性愈伤; B代表在愈伤组织表面长出绒毛状的须根; C代表长出幼苗和根

2.3　不同胚乳状态对愈伤组织的诱导率的影响

无菌接种在MS +2.5mg/L 2，4－D +30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的诱导培养基上的各处理种子培养4～5 d后长出胚芽，几乎没有差异，然后在7～9 d开始陆续从胚芽鞘基部长出淡黄色鲜嫩愈伤组织，观察记录愈伤组织的生长状况，于第21天统计诱导率，结果如表2所示。试验结果表明，就起始出愈时间而言，3种处理基本一致，差异不显著，且4个品种基本保持一致;就愈伤组织的生长速度而言，全胚乳处理＞半胚乳处理＞无胚乳处理。全胚乳处理的愈伤组织在愈伤组织生长早期生长特别旺盛，但在生长后期速度变慢，半胚乳处理和无胚乳处理的愈伤组织早期生长速度不及全胚乳处理，但在整个21 d的诱导期内基本保持同一个生长速度。就诱导率而言，半胚乳处理＞全胚乳处理＞无胚乳处理(表2)，就愈伤组织的质量而言，无胚乳处理的愈伤组织质地紧实，细胞质浓密，大多为黄色，半胚乳处理的愈伤组织质地较紧实，颗粒状，为淡黄色，全胚乳处理的愈伤组织生长旺，质地较疏松，大部分黄色，有极少数呈深黄色，有进一步褐化的趋势。由此可见，半胚乳处理能得到更多且胚性较好的愈伤组织。

表2　不同胚乳状态对愈伤组织诱导率的影响

2.4　干燥处理对愈伤组织分化率的影响

愈伤组织在转到分化培养基之前进行干燥处理，可以明显提高植株再生诱导率。笔者将仅继代10 d的水稻胚性愈伤组织置于上下各铺有2层滤纸的培养皿中，用封口膜封好置于25℃暗培养箱干燥处理4 d，使愈伤组织失水约50%，再转移到分化培养基中。2周后变绿愈伤组织频率为52.7%，较对照高出11.3%，又过2周后未能变绿的愈伤组织开始出现褐化，但与对照相比褐化率有所降低，说明分化前的干燥处理有利于愈伤组织变绿和降低褐化率。这可能是因为干燥处理使愈伤组织中水分含量降低，在一定程度上还造成细胞饥饿，引起了细胞生理生化过程的变化，而这些变化可能正是诱导植株再生所需要的。

3　讨论

离子束生物工程是20世纪80年代在我国兴起的，其原理是利用低能离子束注入生物体，质量沉积能量沉积和电荷交换导致生物材料产生一定的生物学效应。离子束生物技术发展起来后，在农作物育种和遗传改良上得以广泛应用。水稻体细胞无性系的诱导技术被研究者应用于作物遗传育种的实践中并取得了很大的经济效益。然而，前人的大多数研究结果都是以二倍体水稻为材料所获得，其局限性相当明显。关于四倍体水稻的潜在价值，近年来已经引起了一些研究者的关注^［4］。笔者利用低能氮离子束对同源四倍体水稻进行注入处理，从其后代群体内中筛选到具有双胚苗遗传特性的突变株，然后以这一材料进行无性系诱导，并结合其2个近亲系和1个介导品系展开研究。

本项研究的结果表明，利用激素的调节作用可以提高试验材料组织培养的效率，2，4－D的浓度对水稻愈伤组织的诱导起着重要作用，2，4－D的最适浓度因水稻基因型的不同而有差异。二倍体水稻在2，4－D浓度为2.0mg/L时能得到较高的诱导率且愈伤组织质量好，这与李玉静等^［7］的研究结果相吻合，但笔者的试验材料以同源四倍体为主，这一常用的浓度不能满足四倍体水稻的诱导需求，试验结果表明当浓度提高到2.5mg/L时，在保证愈伤组织较好的质量的同时也提高了其诱导率。可能是因为染色体的加倍使得一部分基因的表达量也相应增加，并对原有的激素代谢水平进行了调整，故需要较高浓度的生长素进行诱导脱分化。林拥军等^［8］研究发现，成熟种子所携带的胚乳量的多少直接对其的诱导和愈伤组织分化产生很大影响，种子本身所携带的胚乳量越少，则其本身生长素调节能力越弱，在外界过量生长素条件下缓冲的能力也就越弱，则越容易进行脱分化的启动。但切胚乳处理较费时费力，不及全胚乳处理方便快捷，在无胚乳处理过程中，极易不小心使种胚破损，同时在消毒时裸露的种胚也极易受到伤害，从而影响到诱导率，半胚乳处理比无胚乳处理容易操作，且种胚不容易受到伤害，在保证较高诱导率的同时愈伤组织质量也高。相比之下，全胚乳处理虽然方便，但诱导率略低，且愈伤组织质量不及半胚乳处理。综合考虑认为，半胚乳处理效果最佳干燥处理提高愈伤组织分化率的可能原因是干燥处理作为一种胁迫会迫使细胞处于一种饥饿和脱水状态，而改变细胞的代谢，增强其对逆境的适应而导致再生事件的发生。离子束生物技术与无性系诱导技术完美的结合为水稻超高产育种创造出更多、更优的水稻种质资源，进一步挖掘了同源四倍体水稻的潜在利用价值，也为无融合生殖潜力的挖掘和利用提供了一条新的途径。

参考文献

［1］袁隆平．杂交水稻的育种战略设想［J］．杂交水稻，1987，2(1):1－3．

［2］黄群策．被子植物的无融合生殖［M］．福州:福建科学技术出版社，2000．

［3］黄群策，孙梅元，邓启云．多倍体水稻及其潜在价值［J］．杂交水稻，2001，16(1):1－3．

［4］黄群策．稻属植物染色体组多倍化的潜在价值［J］．郑州大学学报，2008，40(2):108－113．

［5］余增亮．离子束生物技术引论［M］．合肥:安徽科学技术出版社，1998: 1－3．

［6］黄群策，代西梅．低能氮离子对不同倍性水稻的诱变效应［J］．杂交水稻，2004，19(3):57－61．

［7］李玉静，陈彦龙，王玲玲，等.2，4－D和6－BA对水稻愈伤组织培养力的影响［J］．河北师范大学学报(自然科学版)，2005，29(4):395－398．

［8］林拥军，邹玉兰，万骅，等．水稻成熟胚组培过程中胚乳影响的研究［J］．江西农业大学学报，1996，18(3):259－263．

【注释】

(1)该文曾在《中国稻米》 ［2010，16(5):51～54］刊出