离子注入提高同源四倍体水稻的诱变效果

离子注入后对同源四倍体水稻的诱变效应⁽¹⁾

黄群策　彭建军　李玉峰

摘要　选用不同倍性的水稻材料进行低能氮离子束的注入实验，试图研究离子注入后的效果与其材料染色体组倍性之间的关系。研究结果表明，同源四倍体水稻比二倍体水稻对低能氮离子束注入处理更敏感;在同源四倍体水稻群体中所出现的变异频率比在二倍体水稻群体中所出现的变异频率要高一些，即在同源四倍体群体中所出现的变异单株明显地多于在二倍体群体中所出现的变异单株;在经过低能氮离子束注入处理的同源四倍体后代群体中已经分别筛选到结实率高达90.16%的单株和具有双胚苗性状的单株，同源四倍体水稻的高结实率特性和双胚苗特性表现出一定的可遗传性。由此可见，利用低能离子注入技术对同源四倍体水稻进行遗传改良的效果值得肯定，这将为解决同源四倍体水稻结实率难题和挖掘其潜在的利用价值寻找到一个新的突破口。

关键词　同源四倍体水稻;低能氮离子束;诱变效应

20世纪70年代中期我国籼型杂交水稻在生产成功地推广应用标志着我国水稻遗传改良的研究工作已经步入世界前列。为了进一步提高水稻的单位面积产量，我国学者在20世纪90年代中期提出了我国超级稻育种的战略设想，由此引起了国际上同行专家的震惊^［1－3］。目前，我国水稻遗传改良的研究主要面临着两大难题有待于进一步探索，即怎样通过更有效的遗传改良方法和途径在现有的产量水平上进一步实质性地提高农作物的单位面积产量(即更有效地挖掘其杂种优势效应)和简化农作物杂种优势利用的程序(即固定其杂种优势效应)。从农作物遗传改良的发展进程来看，研究方法的创新主要围绕着两个方面展开，即如何更有效地创造出丰富多彩的遗传性变异群体和怎样更准确地筛选出具有实用价值的优良基因型。

在创造遗传性变异群体的过程中，无论是物理学方法还是化学方法，都会涉及多种多样的诱变源或诱变剂。在20世纪80年代中期被挖掘的低能离子束生物技术，在创造遗传性变异群体方面具有新颖性，即低能离子束作为新的诱变源具有质量沉积、能量沉积、电荷交换这种特异性三位一体的功效，它对生物体的作用主要表现为促使细胞中的内容物发生原子位移、重组和化合。在操作过程中，注入离子的数量可以调节，注入离子的射程可以控制。在对试验材料损伤比较轻的诱变状态中，可以获得比较高的诱变率和比较宽的诱变谱^［4，5］。近年来的研究结果表明，同源四倍体水稻具有生长势强、生物学产量高、籽粒大、米质好和抗逆性强以及特殊的生殖发育特性等特点，这已经引起了一些水稻研究者的关注^［6－8］。根据离子束生物技术的特殊性和实用性，我们以低能氮离子束为诱变源，对同源四倍体水稻进行诱变处理，旨在对其诱变后的生物学效应进行研究，以便筛选出具有实用价值的同源四倍体水稻新种质。

1　材料和方法

在试验中选用6份同源四倍体水稻品系［即99－01₍₄₎、99－02₍₄₎、99－03₍₄₎、99－04₍₄₎ 、99－05₍₄₎、99－06₍₄₎］和6份相应的二倍体水稻品系［即99－01₍₂₎、99－02₍₂₎、99－03₍₂₎、99－04₍₂₎ 、99－05₍₂₎、99－06₍₂₎］为试验材料。99－01₍₂₎、99－02₍2)和99－03₍2)这3份材料为籼型二倍体水稻品系，而另外3份则为粳型二倍体水稻品系。利用种芽加倍法对这6份二倍体水稻品系进行染色体组加倍后筛选到相应的6份同源四倍体水稻品系，这些试验材料都是经过多年选育后所获得的遗传性稳定材料^［9］。

在试验中以能量为25 keV的氮离子束为诱变源，采用4种离子剂量，即处理Ⅰ(1×10¹⁷N⁺/cm²)、处理Ⅱ(2×10¹⁷N⁺/cm²)、处理Ⅲ(3×10¹⁷N⁺/cm²)和处理Ⅳ(4×10¹⁷N⁺/cm²)，在真空靶室内对试验材料的种胚进行离子注入处理。在离子注入处理中所采用的仪器设备为由中国科学院等离子体物理研究所自制的LCD－1000多功能离子注入机。实验设3次重复，在每一次重复试验中每份试验材料包括200粒去壳的水稻种子，因而在本次试验中进行低能氮离子束注入处理的水稻种子数共计7 200粒。除此之外，在每份水稻材料中选用200粒去壳种子，随同被处理材料一起放在真空条件下而不进行低能氮离子束注入处理，以此作为对照。

在试验中首先将每份水稻种子去壳，将其插入并固定在盛有花泥的培养皿中。种子的胚部露在花泥的外面(即种胚朝上露出)，以便能直接受到低能氮离子束的照射。在真空(静真空度为10^－6Pa，工作真空度为10^－6Pa)条件下每份试验材料所接受的照射剂量依试验设计不同而异。在经过低能氮离子束注入处理后所有试验材料的种子再按照常规水稻的浸种催芽方法在温度为30℃条件下进行浸种和催芽。在浸种后15 d考查试验材料的萌发率、成苗率和致死率。随后，将已经成苗的实验材料寄栽到实验盆内。当实验材料具有5～6片真叶时再按照30cm×25cm行株距将其移栽至大田让其在自然条件下生长发育。在成熟期，以水稻的主要农艺性状为考查对象，统计群体内变异单株出现的频率，以便研究低能氮离子束的生物学效应。根据水稻育种目标和常规育种方法对实验材料进行鉴定和筛选。在被低能氮离子束注入处理的当代实验材料中我们分别筛选到一些比较特殊的变异单株。随后，在隔离条件下让其自交繁殖，按单株留种，由此形成第二代群体，对其变异性状的稳定性进行了观察研究。

2　试验结果

2.1　离子注入处理后试验材料的发芽率和成苗率

对试验结果进行统计分析后发现，随同被处理材料一起放在真空条件下而不进行低能氮离子束注入处理的所有材料都有比较高的萌发率和成苗率(同源四倍体水稻的变幅分别为81.5%～90.0%和80.0%～88.5%，二倍体水稻的变幅分别为83.5%～92.0%和82．0%～89.5%)，这说明真空条件对其没有明显的生物学效应。对于经过低能氮离子束注入处理的12份水稻材料，其萌发率、成苗率和致死率依材料种类不同而异。从试验处理来看，处理Ⅰ中所获得的结果与未经过低能氮离子束注入处理的对照中所获得的结果类似，这说明当处理的离子剂量为1×10¹⁷N⁺/cm²时还不足以引起实验材料产生相应的生物学效应。在处理Ⅱ中所获得的实验结果表明，6份同源四倍体水稻［即99－01₍₄₎、99－02₍₄₎、99－03₍₄₎、99－04₍₄₎ 、99－05₍₄₎、99－06₍₄₎］的萌发率和成苗率与处理Ⅰ中所获得的结果相比表现为明显降低，致死率非常高。6份相应的二倍体水稻［即99－01₍₂₎、99－02₍₂₎、99－03₍₂₎、99－04₍₂₎ 、99－05₍₂₎、99－06₍₂₎］的萌发率和成苗率与处理Ⅰ中所获得的结果相比并没有表现出明显差异，其致死率也是如此。这些研究结果说明，在处理Ⅱ的试验中低能氮离子束注入处理后对同源四倍体水稻产生了相应的生物学效应，而对二倍体水稻的生物学效应不明显，即同源四倍体水稻对低能离子束注入处理所表现的敏感性比相应的二倍体水稻更明显(表1)。

表1　氮离子注入后实验材料的发芽率和成苗率　　　　　%

从处理Ⅲ的实验结果来看，6份同源四倍体水稻的萌发率和成苗率与处理Ⅱ中所获得的实验结果相比则更低，致死率更高，而6份相应的二倍体水稻的萌发率和成苗率也受到了明显的影响，致死率也比较高。这些实验结果说明，低能氮离子束注入处理后同源四倍体水稻所受到的损伤比二倍体水稻所受到的损伤更严重。从处理Ⅳ的实验结果来看，6份同源四倍体水稻的致死率非常高，萌发率均为0，不能获得存活植株，而6份相应的二倍体水稻的致死率也非常高，其萌发率和成苗率均非常低而致死率非常高(表1)。由此可见，在本试验中对同源四倍体水稻而言处理Ⅳ的离子束剂量太高，不宜采用。

2.2　低能氮离子束注入处理后当代的变异率

在未经过低能氮离子束注入处理的12份水稻材料的当代群体内没有发现具有明显变异特征的单株，在田间条件下各群体的主要农艺性状整齐一致，而在经过低能氮离子束注入处理的12份水稻材料的当代群体内出现了各种各样的变异单株，其变异频率依材料类型不同而异，也因不同处理而表现不同。在各种变异类型中包括生育期变异、株高变异、叶长变异、叶宽变异、叶色变异、叶鞘变异、粒型变异、米质变异、穗型变异、育性变异、生长势变异、结实率变异、生殖发育性状变异和抗寒性变异等等。

从材料类型来看，在同源四倍体水稻群体中所出现的变异频率比在二倍体水稻群体中所出现的变异频率要高一些。在处理Ⅱ和处理Ⅲ中，6份同源四倍体水稻的平均变异频率为10.17%(注:在处理Ⅰ中离子束注入材料与对照材料在成苗率上无明显差异，而在处理Ⅳ中没有获得成活苗)，每份材料发生变异的变幅为7.14%～13.58%。在处理Ⅲ和处理Ⅳ中，6份相应的二倍体水稻的平均变异频率为2.92% (注:在处理Ⅰ和处理Ⅱ中离子束注入材料与对照材料在成苗率上无明显差异)，每份材料发生变异的变幅为1.04%～5.48%(表2)。由此可见，经过低能离子束注入处理之后，尽管不同类型的试验材料对低能离子束的敏感性不同，但诱变效应的差异性相当明显，即在同源四倍体群体中所出现的变异单株明显地多于在二倍体群体中所出现的变异单株。

表2　低能氮离子束注入处理后当代的变异率　　　　　%

注:同源四倍体水稻群体中的变异率以处理Ⅱ和处理Ⅲ中的成活植株数为基础，而二倍体水稻群体中的变异率以处理Ⅲ和处理Ⅳ中的成活植株数为基础(www.chuimin.cn)

根据试验材料在田间的表现对其进行了单株筛选。在同源四倍体水稻99－01₍₄₎和99－06₍₄₎的变异群体内分别发现9株和6株结实率均达到81.0%以上的单株，其中在99－01₍₄₎群体内有1个单株的结实率高达90.16%;在99－01₍₄₎的变异群体内发现1株具有双胚苗性状的单株;在99－02₍₂₎的变异群体内发现1株具有红心米性状的单株。高结实率单株的筛选为挖掘同源四倍体水稻的潜在价值找到了新的突破口;同源四倍体水稻的双胚苗单株的选育将为水稻无融合生殖的研究提供有潜在价值的新材料;红心米材料的发现将有助于对现有的稻米品质进行有效的改良。根据我们确定的水稻育种目标，对于这3种比较特殊的变异性状的分离动态和稳定性进行了进一步观察研究。

2.3　低能氮离子束注入处理后变异群体的生物学效应

通过单株筛选后获得变异单株，再由变异单株通过自交产生第二代群体。在第二代群体中，除了叶鞘变异和米质变异这两个变异性状能稳定遗传之外，其他变异性状在群体内都发生了明显的性状分离现象。在被低能氮离子束注入处理后的绿色叶鞘亲本群体内所发现的紫色叶鞘变异单株，其第二代群体内的各单株仍然保持紫色叶鞘性状，而具有红心米性状的变异单株，其第二代群体内的各单株也保持着红心米性状不变。

在同源四倍体水稻99－01₍₄₎的变异群体内所发现的9株结实率比较高的单株组成9个株系，在其第二代群体中的每一个株系内各单株的结实率出现明显的分离现象。在各个株系内，包括高结实率单株(80.64%～88.45%)、中等结实率单株(46.55%～53.65%)和低结实率单株(0～10.75%)。在其第二代群体内单株结实率性状的表现呈现出数量性状的变异特征，即结实率性状在第二代群体中呈连续性分布，平均结实率为50.88%，最高结实率为88.45%，最低结实率为0。在同源四倍体水稻99－06₍₄₎的6个结实率比较高的株系内各单株的结实率也发生明显的分离现象。在各个株系内，也包括高结实率单株(82.64%～89.60%)、中等结实率单株(35.44%～66.49%)和低结实率单株(0～12.80%)。

在同源四倍体水稻99－01₍₄₎的变异群体内所发现的1株双胚苗单株所产生的第二代群体内也出现明显的分离现象。通过将双胚苗植株中的两个单株分别进行标记后，获得了两个单株分别产生的第二代群体。进一步的观察结果表明，在一个群体(定名为A群体)内双胚苗出现的频率为2.35%，在另一个群体(定名为B群体)内双胚苗出现的频率为2.16%，两者没有明显的差异。随后，在两个群体内分别随机地收取种子。发芽实验结果表明，在A群体内双胚苗出现的频率为2.08%，在B群体内双胚苗出现的频率为2.11%，两者也没有明显的差异。由此可见，在同源四倍体水稻99－01₍₄₎中所筛选到的双胚苗单株，其双胚苗特性表现出一定的可遗传性，但其频率太低，这有待于深入研究，其双胚苗特性的胚胎学机制也值得进一步研究。

3　讨论

现代植物遗传育种的历史经验已经充分地说明，育种新材料的发现、育种新方法的建立、育种新思路的提出，都有可能使植物遗传育种水平得到明显提高，从而，能够有效地挖掘其增产潜力和实用价值。通过染色体组多倍化之后所获得的多倍体水稻(包括同源多倍体水稻和异源多倍体水稻)具有生长势强、生物学产量高、籽粒大、米质好和抗逆性强等特点，这在几十年前就已经引起了一些水稻育种者的关注。然而，由于多倍体水稻存在着一些难以克服的不良性状，致使这项研究工作尚未取得突破性进展^［6，7］。前人的研究结果表明，低能离子束生物技术在作物育种中实用性已经被大量的研究结果所证实，也引起了一些研究者的关注和重视^［10］。根据同源四倍体水稻具有特殊的生殖发育特性，其遗传可塑性比较强而保守性比较弱，我们选用不同倍性的水稻材料进行低能氮离子束的注入实验，试图研究离子注入后的效果与其材料染色体组倍性之间的关系。研究结果表明，同源四倍体水稻比二倍体水稻对低能氮离子束注入处理更敏感;在同源四倍体水稻群体中所出现的变异频率比在二倍体水稻群体中所出现的变异频率要高一些，即在同源四倍体群体中所出现的变异单株明显地多于在二倍体群体中所出现的变异单株;在经过低能氮离子束注入处理的同源四倍体后代群体中已经筛选到结实率高达90.16%的单株和具有双胚苗性状的单株，同源四倍体水稻的高结实率特性和双胚苗特性表现出一定的可遗传性。由此可见，利用低能离子注入技术对同源四倍体水稻进行遗传改良的效果值得肯定，这将为解决同源多倍体水稻结实率难题和挖掘其潜在的利用价值寻找到一个新的突破口，为在同源四倍体水平利用水稻更强大的杂种优势寻找到新的途径。

参考文献

［1］袁隆平．杂交水稻选育的回顾、现状与展望［J］．中国稻米，1999，12(1):3－6．

［2］袁隆平．杂交水稻超高产育种［J］．杂交水稻，2001，16(1):1－3．

［3］中国农学会，中国水稻研究所，国家杂交水稻工程技术研究中心.21世纪世界水稻遗传育种展望［M］．北京:中国农业科技出版社，1999．

［4］Yu Zengliang，Yang Jianbo，Wu Yuejin.Transferring Gus gene into intact rice cells by low energy ion beam［J］.Nuclear Instruments andmethods in Physics Research，1993，B80/81: 1328－1331．

［5］余增亮．离子束生物技术引论［M］．合肥:安徽科学技术出版社，1998．

［6］黄群策，孙梅元，邓启云．同源四倍体水稻的潜在价值研究［J］．杂交水稻，2001，16(1):1－3．

［7］黄群策．被子植物的无融合生殖［M］．福州:福建科技出版社，2000．

［8］蔡得田，袁隆平，卢兴桂．二十一世纪水稻育种新战略——Ⅱ利用远缘杂交和多倍体双重优势进行超级稻育种［J］．作物学报，2001，27(1):110－116．

［9］黄群策，孙敬三，朱生伟．种芽诱导获得同源四倍体水稻的技术［J］．中国农学通报，1997，3(6):21－23．

［10］黄群策，李玉峰．离子束生物技术在水稻育种中的应用前景［J］．杂交水稻，2002，17(5):53－56．

【注释】

(1)该文曾在《河南农业科学》 ［2006，34(4):24～27］刊出