低能氮离子注入四倍体水稻的生物学效应研究

低能氮离子注入同源四倍体水稻的生物学效应⁽¹⁾

黄群策　梁秋霞　李玉峰　余增亮

摘要　以低能氮离子束为诱变源，对同源四倍体水稻进行注入处理后，对其生物学效应进行了研究。研究结果表明，同源四倍体水稻比二倍体水稻对低能氮离子束注入处理更敏感。在注入离子剂量为3×10¹⁷N⁺/cm²时，同源四倍体水稻所受到的损伤比二倍体水稻所受到的损伤更严重。4份同源四倍体水稻［即IR₃₆₍₄₎、IR28₍₄₎、紫血稻₍₄₎、明恢₆₃₍₄₎］的成苗率分别是2.0%、3.5%、3.0%和4.0%，致死率非常高。在同样条件下，4份相应的二倍体水稻［即IR₃₆₍₂₎、IR₂₈₍₂₎、紫血稻₍₂₎、明恢₆₃₍₂₎］的成苗率分别是33.0%、31.5%、29.0%和24.5%，致死率也比较高。在经过注入处理后的当代群体内，4份同源四倍体水稻的平均变异频率为32.5%，而4份相应的二倍体水稻的平均变异频率为9.5%。在同源四倍体水稻IR₃₆₍₄₎和IR₂₈₍₄₎的变异群体内分别发现22株和14株结实率均达到75.0%以上的单株，其中在IR₃₆₍₄₎群体内有1单株的结实率高达91.89%;在紫血稻₍₄₎的变异群体内发现2株具有双胚苗性状的单株;在二倍体水稻明恢₆₃₍₂₎的变异群体内发现1株具有红心米性状的单株。在第二代群体中，除了叶鞘变异和米质变异这两个变异性状能稳定遗传之外，其他变异性状在群体内都发生了明显的性状分离现象。同源四倍体水稻的高结实率特性和双胚苗特性表现出一定的可遗传性。

关键词　同源四倍体水稻;低能氮离子束;生物学效应

离子束生物技术是低能重离子生物学的一个重要组成部分。离子束生物技术本身具有独特的技术原理和简单的操作程序，在作物育种中其实用性已经被越来越多的研究结果所证实，也引起了越来越多研究者的关注和重视^［1，2］。目前，我国水稻育种面临着两大难题有待攻关，即怎样通过有效的方法和途径在现有的产量水平上更有效地挖掘水稻的杂种优势效应和固定水稻的杂种优势效应。为了提高水稻的单位面积产量，我国学者在20世纪90年代中期提出了我国超级稻育种的战略设想，由此引起了国际上同行专家的震惊^［3－5］。从水稻育种的发展进程来看，水稻育种方法的创新主要围绕着两个方面展开研究，即如何更有效地创造出丰富多彩的遗传性变异群体和怎样更准确地筛选出具有实用价值的优良基因型。近年来的研究结果表明，在同源四倍体水平利用原始亚种间强大的杂种优势效应来进一步提高水稻的增产潜力则是水稻育种中值得探索的新的研究方向^［6，7］。同源四倍体水稻具有生长势强、生物学产量高、籽粒大、米质好和抗逆性强等特点，这在几十年前就已经引起了一些水稻育种者的关注。然而，同源四倍体水稻的结实率都比较低，这是限制其被生产上广泛利用的主要原因。关于低能离子束生物技术在二倍体水稻遗传改良中的应用，前人已有一些研究^［1］，但有关利用低能离子注入技术对同源四倍体水稻进行遗传改良方面的工作尚未见公开的文献报道。根据离子束生物技术的特殊性和实用性，我们以低能氮离子束为诱变源，对同源四倍体水稻进行诱变处理，旨在对其诱变的生物学效应进行研究，以便筛选出具有实用价值的同源四倍体水稻新种质。

1　材料和方法

在实验中以能量为25 keV的氮离子束为诱变源，采用4种离子剂量，即处理Ⅰ(1×10¹⁷N⁺/cm²)、处理Ⅱ(2×10¹⁷N⁺/cm²)、处理Ⅲ(3×10¹⁷N⁺/cm²)和处理Ⅳ(4×10¹⁷N⁺/cm²)对同源四倍体水稻和相应的二倍体水稻的种胚进行离子注入处理。在离子注入处理中所采用的仪器设备为由中国科学院等离子体物理研究所自制的LCD－1000多功能离子注入机。

在实验中选用4份同源四倍体水稻［即IR₃₆₍₄₎、IR₂₈₍₄₎、紫血稻₍₄₎、明恢₆₃₍₄₎］和4份相应的二倍体水稻即IR₃₆₍₂₎、IR₂₈₍₂₎、紫血稻₍₂₎、明恢63₍₂₎为实验材料。

这些实验材料都是经过多年选育后所获得的遗传性稳定材料^［8，9］。实验设3次重复，在每1次重复中每份材料包括200粒去壳的水稻种子，在本次实验中进行低能氮离子束注入处理的水稻种子数共计4 800粒。除此之外，在每份水稻材料中选用200粒去壳种子，随同被处理材料一起放在真空条件下而不进行低能氮离子束注入处理，以此作为对照。

首先将每份水稻种子去壳，将其插入并固定在盛有花泥的培养皿中。种子的胚部露在花泥的外面(即种胚朝上露出)，以便能直接受到低能氮离子束的照射。在真空(静真空度为10^－6Pa，工作真空度为10^－6Pa)条件下每份材料所接受的照射剂量依实验设计不同而异。所有的种子经过低能氮离子束注入处理后再按照常规方法在温度为30℃的条件下进行浸种和催芽。在浸种后15 d考查实验材料的萌发率、成苗率和致死率。随后，将已成苗的实验材料寄栽到实验盆内。当实验材料具有5～6片真叶时再按照30cm×25cm行株距将其移栽至大田让其在自然条件下生长发育。在成熟期，以水稻的主要农艺性状为考查对象，统计群体内变异株出现的频率，以便研究低能氮离子束的生物学效应。

根据水稻育种目标和常规育种方法对实验材料进行鉴定和筛选。在被低能氮离子束注入处理的当代的实验材料中我们分别筛选到一些比较特殊的变异单株(如结实率达到正常水平的同源四倍体水稻、表现双胚苗性状的同源四倍体水稻、表现红心米特性的二倍体水稻等)。对于在低能氮离子束注入处理后当代所出现的变异单株，我们在隔离条件下让其自交繁殖，按单株留种，由此形成第二代群体，对其变异性状的稳定性进行了观察研究。

2　实验结果

2.1　低能氮离子束注入处理后当代的成苗率

统计结果表明，被放在真空条件下而未经过低能氮离子束注入处理的8份水稻材料，其萌发率、成苗率和致死率依材料种类不同而异。4份同源四倍体水稻即IR₃₆₍₄₎、IR₂₈₍₄₎、紫血稻₍₄₎、明恢₆₃₍₄₎的萌发率分别是92.5%、90.0%、89.5%和94.5%，成苗率分别是92.5%、90.0%、89.5%和94.0%，致死率非常低。4份相应的二倍体水稻即IR₃₆₍₂₎、IR₂₈₍₂₎、紫血稻₍₂₎、明恢₆₃₍₂₎的萌发率分别是96.0%、98.0%、96.5%和98.5%，成苗率分别是95.5%、98.0%、96.5%和98.0%，致死率也非常低。这些结果说明，随同被处理材料一起放在真空条件下而不进行低能氮离子束注入处理的所有材料都有比较高的萌发率和成苗率，真空条件对其没有明显的生物学效应。

对于经过低能氮离子束注入处理的8份水稻材料，其萌发率、成苗率和致死率也依材料种类不同而异。从实验处理来看，处理Ⅰ中所获得的结果与未经过低能氮离子束注入处理的对照中所获得的结果类似，这说明当处理的离子剂量为1×10¹⁷N⁺/cm²时还不足以引起实验材料产生相应的生物学效应。在处理Ⅱ中所获得的实验结果表明，4份同源四倍体水稻即IR₃₆₍₄₎、IR₂₈₍₄₎、紫血稻₍₄₎、明恢₆₃₍₄₎的萌发率和成苗率与处理Ⅰ中所获得的结果相比明显降低，致死率非常高。4份相应的二倍体水稻即IR₃₆₍₂₎、IR₂₈₍₂₎、紫血稻₍₂₎、明恢₆₃₍₂₎的萌发率和成苗率与处理Ⅰ中所获得的结果相比没有明显差异，致死率也是如此。这些研究结果说明，低能氮离子束注入处理后对同源四倍体水稻产生了相应的生物学效应，而对二倍体水稻的生物学效应不明显。

在处理Ⅲ中所获得的实验结果表明，4份同源四倍体水稻即IR₃₆₍₄₎、IR₂₈₍₄₎、紫血稻₍₄₎、明恢₆₃₍₄₎的萌发率和成苗率与处理Ⅲ中所获得的实验结果相比则更低，致死率更高。4份相应的二倍体水稻即IR₃₆₍₂₎、IR₂₈₍₂₎、紫血稻₍₂₎、明恢₆₃₍₂₎的萌发率和成苗率也受到了明显的影响，致死率也比较高。这些实验结果说明，低能氮离子束注入处理后同源四倍体水稻所受到的损伤比二倍体水稻所受到的损伤更严重。在处理Ⅳ中所获得的实验结果表明，4份同源四倍体水稻的致死率非常高，萌发率均为0，不能获得存活植株。4份相应的二倍体水稻的致死率也非常高，其萌发率和成苗率均非常低而致死率非常高(表1)。由此可见，处理Ⅳ的离子剂量太高，不宜采用。

表1　氮离子注入后实验材料的发芽率和成苗率　　　　　%

2.2　低能氮离子束注入处理后当代的变异率

观察结果表明，未经过低能氮离子束注入处理的8份水稻材料，在其当代群体内没有发现具有明显变异特征的单株，各群体的农艺性状整齐一致，而在经过低能氮离子束注入处理的8份水稻材料的当代群体内出现了各种各样的变异单株，其变异频率依材料类型不同而异，也因不同处理而表现不同。总的来看，在同源四倍体水稻群体中所出现的变异频率比在二倍体水稻群体中所出现的变异频率要高一些。在处理Ⅱ和处理Ⅲ中，4份同源四倍体水稻的平均变异频率为32.5% (注:在处理Ⅰ中离子束注入材料与对照材料在成苗率上无明显差异，而在处理Ⅳ中没有获得成活苗)。在处理Ⅲ和处理Ⅳ中，4份相应的二倍体水稻的平均变异频率为9.5%(注:在处理Ⅰ和处理Ⅱ中离子束注入材料与对照材料在成苗率上无明显差异)。在各种变异类型中包括生育期变异、株高变异、叶长变异、叶宽变异、叶色变异、叶鞘变异、粒型变异、米质变异、穗型变异、育性变异、生长势变异、结实率变异、生殖发育性状变异和抗寒性变异等等。在观察中发现，某些变异单株具有单一的变异性状，而大多数变异单株同时具有多个变异性状。特别值得注意的是，在同源四倍体水稻IR₃₆₍₄₎和IR₂₈₍₄₎的变异群体内分别发现22株和14株结实率均达到75.0%以上的单株，其中在IR₃₆₍₄₎群体内有1个单株的结实率高达91.89%;在紫血稻₍₄₎的变异群体内发现2株具有双胚苗性状的单株;在二倍体水稻明恢₆₃₍₂₎的变异群体内发现1株具有红心米性状的单株。高结实率单株的筛选为挖掘同源四倍体水稻的潜在价值找到了新的突破口;同源四倍体水稻的双胚苗单株的选育将为水稻无融合生殖的研究提供有价值的新材料;红心米材料的发现将有助于对现有的稻米品质进行有效的改良。根据我们确定的水稻育种目标，对于这3种比较特殊的变异性状的分离动态和稳定性进行了进一步观察研究。(www.chuimin.cn)

2.3　低能氮离子束注入处理后第二代群体的生物学效应

在第二代群体中，除了叶鞘变异和米质变异这两个变异性状能稳定遗传之外，其他变异性状在群体内都发生了明显的性状分离现象。在被低能氮离子束注入处理后的绿色叶鞘亲本群体内所发现的紫色叶鞘变异单株，其第二代群体内的各单株仍然保持紫色叶鞘性状，而具有红心米性状的变异单株，其第二代群体内的各单株也保持着红心米性状不变。

在同源四倍体水稻IR₃₆₍₄₎的变异群体内所发现的22株高结实率单株，其第二代群体内出现明显的分离现象。在各株系内，包括高结实率单株、中等结实率单株和低结实率单株，结实率性状的表现呈现出数量性状的特征，即结实率性状在第二代群体中呈连续性分布，平均结实率为61.62%，最高结实率为86.64%，最低结实率为47.89%。通过观察鉴定后，我们已经筛选到40个比较好的单株，其结实率在80%以上，综合农艺性状比较优良。在同源四倍体水稻IR₂₈₍₄₎的变异群体内所发现的14株高结实率单株，其第二代群体内出现的分离现象也是如此，平均结实率为59.71%，最高结实率和最低结实率分别为87.86%和51.49%。

在同源四倍体水稻紫血稻₍₄₎的变异群体内所发现的1株双胚苗单株所产生的第二代群体内也出现明显的分离现象。通过将双胚苗植株中的两个单株分别进行标记后，获得了两个单株分别产生的第二代群体。研究结果表明，在一个群体(定名为A群体)内双胚苗出现的频率为5.12%，在另一个群体(定名为B群体)内双胚苗出现的频率为4.98%，两者没有明显的差异。随后，在两个群体内分别随机地收取种子。发芽实验结果表明:在A群体内双胚苗出现的频率为5.08%，在B群体内双胚苗出现的频率为5.11%，两者也没有明显的差异。由此可见，在同源四倍体水稻紫血稻₍₄₎中所筛选到的双胚苗单株，其双胚苗特性表现出一定的可遗传性，但其频率太低，这有待于深入研究，其双胚苗特性的胚胎学机制也值得进一步研究。

3　讨论

水稻育种的历史经验已经充分地说明，育种新材料的发现、育种新方法的建立、育种新思路的提出，都有可能使水稻育种水平得到明显提高，从而，能够有效地挖掘水稻的增产潜力。多倍体水稻(包括同源多倍体水稻和异源多倍体水稻)具有生长势强、生物学产量高、籽粒大、米质好和抗逆性强等特点，这在几十年前就已经引起了一些水稻育种者的关注。然而，由于多倍体水稻存在着一些难以克服的不良性状，致使这项研究工作尚未取得突破性进展。前人的研究结果表明，离子束生物技术在作物育种中实用性已经被大量的研究结果所证实，也引起了一些研究者的关注和重视。关于利用离子束生物技术对二倍体水稻进行遗传改良的研究，前人已有一些报道^［1，2］，而关于利用离子注入技术对同源四倍体水稻进行遗传改良的研究则尚未见到公开的文献资料。本实验的研究结果表明，同源四倍体水稻比二倍体水稻对低能氮离子束注入处理更敏感。在注入离子剂量为3×10¹⁷N⁺/cm²时，同源四倍体水稻所受到的损伤比二倍体水稻所受到的损伤更严重。4份同源四倍体水稻即IR₃₆₍₄₎、IR₂₈₍₄₎、紫血稻₍₄₎、明恢₆₃₍₄₎的成苗率分别是2.0%、3.5%、3.0%和4.0%，致死率非常高。在同样条件下，4份相应的二倍体水稻即IR₃₆₍₂₎、IR₂₈₍₂₎、紫血稻₍₂₎、明恢₆₃₍₂₎的成苗率分别是33.0%、31.5%、29.0%和24.5%，致死率也比较高。在经过注入处理后的当代群体内，4份同源四倍体水稻的平均变异频率为32.5%，而4份相应的二倍体水稻的平均变异频率为9.5%。在同源四倍体水稻IR₃₆₍₄₎和IR₂₈₍₄₎的变异群体内分别发现22株和14株结实率均达到75.0%以上的单株，其中在IR₃₆₍₄₎群体内有1个单株的结实率高达91.89%;在紫血稻₍₄₎的变异群体内发现2株具有双胚苗性状的单株;在二倍体水稻明恢₆₃₍₂₎的变异群体内发现1株具有红心米性状的单株。在第二代群体中，除了叶鞘变异和米质变异这两个变异性状能稳定遗传之外，其他变异性状在群体内都发生了明显的性状分离现象。由此可见，利用低能离子注入技术对同源四倍体水稻进行遗传改良的效果值得肯定，这将为同源多倍体水稻的利用寻找到一个新的突破口，为在同源四倍体水平利用水稻更强大的杂种优势寻找到新的途径。

参考文献

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【注释】

(1)该文曾在《激光生物学报》 ［2003，12(5):355～359］刊出