离子注入后水稻四倍体雄性不育的育性表达特征

离子注入后同源四倍体核雄性不育水稻的育性表达特性⁽¹⁾

黄群策　李玉峰

摘要　以同源四倍体核不育水稻为研究材料，以氮离子束为诱变源完成了离子注入试验。对离子注入群体进行筛选后以变异单株为基础，在育性分化的敏感期经过低温处理后对其育性表达特性进行了研究。研究结果表明，在氮离子注入剂量为1×10¹⁷cm－2的处理中，在同源四倍体核不育水稻的当代群体内出现了比较多的变异单株。在各个变异单株之间其育性表达发生了明显的变异。在育性分化的敏感期经过低温处理后，某些突变体在伴随着发生形态学变异的同时也会发生相应的育性变异，而另一些突变体在发生形态学变异或生育特性变异的情况下仍然保持着其亲本的雄性不育特性。在M3代群体内，各个株系群体内单株之间的农艺性状并没有达到整齐一致的状态，但各个株系在雄性不育性表达上却保持了上一个世代的突变特性。由此认为，氮离子束注入所导致的育性变异在M3代群体内并没有发生进一步的分离。

关键词　同源四倍体水稻;核雄性不育;氮离子注入;育性表达

自从20世纪70年代中期我国水稻杂种优势利用获得实质性突破以来，杂交水稻育种存在着两大技术体系，即以核质互作型雄性不育系为基础的“三系”技术体系和以光温敏核雄性不育系(简称核不育系)为基础的“两系”技术体系。在生产实际中“三系”杂交稻的推广应用速度相当快而“两系”杂交稻的推广应用速度相当慢。对于后者而言，主要原因在于围绕着核不育系在雄性不育期内的育性稳定性和育性转换规律所出现的一些技术性问题还有待于进一步研究。近年来，多倍体水稻在水稻杂种优势研究中所表现出的潜在利用价值再次引起一些研究者的高度关注^［1－2］。在同源四倍体水平核不育水稻所表现出的育性稳定性特点，为水稻育种者在更高层次上进一步挖掘水稻杂种优势潜力提供了良好的新机遇，即同源四倍体核不育水稻将是值得重视的新的种质资源。关于同源四倍体核不育水稻的育性稳定性问题前人已经有过公开的文献报道^［3］。

具有我国独立知识产权的离子束生物工程经过20多年的探索之后其实用性已经被大量的实验结果所证实^［4－6］。利用离子注入技术对同源四倍体核不育水稻进行处理后其雄性不育性的变异特征则是值得研究的问题。本项研究以同源四倍体核不育水稻和相应的二倍体核不育水稻为研究材料，以氮离子束为诱变源完成离子注入试验，旨在研究其后代群体内变异单株的育性表达特点，进而为在多倍体水平核不育水稻的筛选和离子束生物技术在水稻遗传改良上的应用提供参考资料。

1　材料和方法

在本试验中所采用的材料为同源四倍体核不育水稻培矮64s(4)和相应的二倍体核不育水稻培矮64s(2)，它们均具有稳定的遗传基础和整齐一致的农艺性状以及特定的育性表达方式。同源四倍体核不育水稻培矮64s(4)是以二倍体核不育水稻培矮64s(2)为基础通过种芽诱导法诱导之后所筛选到的同源四倍体核不育品系^［7］。在试验中对试验材料进行氮离子束注入的方法按照常规的操作程序^［5］进行。根据不同染色体组倍性的水稻材料对不同离子注入剂量的敏感程度及其生物学效应^［8］，在本试验中所选用的氮离子束注入剂量为1×10¹⁷cm－2，氮离子的能量为25 keV。在试验中首先将各份试验材料的剥壳种子500粒经过表面消毒后将其胚部朝上置于带有花泥的培养皿中，在真空靶室中采用间隔为50 s的脉冲对实验材料进行注入处理。随后，对经过注入处理的当代材料进行常规的育苗和管理。根据试验材料的形态特征对其进行筛选，所筛选到的突变单株作为在人工控制条件下进行育性鉴定的主要试验材料。在经过氮离子束注入处理的培矮64s(4)当代群体内出现了各种各样的形态变异单株或生育特性变异单株，其中包括植株高度变异(比其亲本矮20cm)、生育期变异(比其亲本早熟15 d)、剑叶长度变异(比其亲本短25cm)、颖壳顶端无芒和穗型变异(比其亲本短10cm)等。在试验中将这5种变异单株分别编号为Dwarf－P1、Early－P2、Short－P3、Awnless－P4和Ear－P5。在隔离条件下分别获得其自交结实种子备用。

在人工控制条件下的育性鉴定以原亲本材料和经过离子注入处理后所筛选到的5份同源四倍体突变单株为研究材料。每份试验材料播种后给予良好的肥水条件以便促进其早生快发，在主茎处于8叶期时分别将每一株材料一分为三后分别移栽到试验桶内(每桶内只移栽带有3～4个分蘖的一株材料)，让其在自然条件下生长发育。根据水稻的形态学特点与其幼穗分化时期的相关性，当试验材料发育至花粉母细胞形成期将每份材料中的2桶材料移入人工气候箱(SPX－250－G)内进行连续6 d的恒定性低温处理。每日的光照时间为14h(7: 00～21: 00)，光照强度为6 000 lx，低温强度分为2个档次(23.5℃和20.0℃)。每份材料中的另外1桶材料不进行低温处理而作为对照材料。除此之外，在对变异单株的育性稳定性进行鉴定过程中，以水稻恢复系9311、培矮64s(4)和培矮64s(2)作为对照材料。所有的试验材料在经过低温处理后将其移至自然条件下让其进一步生长发育。

在试验材料抽穗时，利用0.1%I₂－KI溶液分别对花粉粒的染色反应进行镜检并由此确定其花粉粒育性状况。同时，通过套袋隔离后对其自交结实种子数目进行考查，由此确定其自交结实率。随后，以自交结实种子为材料组成M3代群体并对其主要农艺性状和育性稳定性的表现特征进行考查和鉴定。在M3代群体内，从每一种突变体材料中分别选取3个单株进行育性稳定性鉴定，其研究方法如上。对于每一个株系而言，在对试验数据进行处理后取3个单株的平均数对实验结果进行评价。

2　结果与分析

2.1　离子注入后当代群体的特征特性

在本试验中，随同被处理材料一起放在真空条件下而不进行氮离子束注入处理的对照材料都具有比较高的萌发率和成苗率，由此表明真空条件对其没有明显的生物学效应。对于经过氮离子束注入处理的4份试验材料，其萌发率、成苗率和致死率的表现依材料种类不同而异。对于同源四倍体核不育水稻培矮64s(4)而言，被处理材料与相应的对照材料在萌发率、成苗率和致死率上却表现出明显的差异。在被离子注入处理后的500粒种子中，萌发率、成苗率和致死率分别是64.20%、51.20%和48.8%，而对照分别是91.60%、90.20%和9.8%，这说明在本试验的离子注入剂量下对其产生了明显的生物学效应。由此可见，经过氮离子束注入处理后同源四倍体材料所受到的损伤比较明显，这一研究结果与我们过去所获得的研究结果很相似^［6］。

经过氮离子束注入处理后试验材料在当代群体内所表现的变异率值得注意。观察结果表明，随同被处理材料一起放在真空条件下而不进行氮离子束注入处理的对照材料^{［无论是培矮64s(4)还是培矮64s(2)］}，在其当代群体内没有发现其特征特性已经发生明显变异的单株，各群体的农艺性状整齐一致。在对试验材料进行鉴定时发现，在经过氮离子束注入处理后的同源四倍体培矮64s(4)当代群体内出现了多种形态变异或生育特性变异单株，其中包括植株高度变异(比其亲本矮20cm)、生育期变异(比其亲本早熟15 d)、剑叶长度变异(比其亲本短25cm)、颖壳顶端无芒和穗型变异(比其亲本短10cm)等。在试验中将这5种变异单株分别编号为Dwarf－P1、Early－P2、Short－P3、Awnless－P4和Ear－P5。统计结果表明，在同源四倍体培矮64s(4)当代群体内的256株材料中鉴定出12株变异材料，其诱变频率为4.69%。由此可见，氮离子束注入处理后对同源四倍体核不育水稻所产生的变异效应比较明显。

2.2　变异单株的育性表达特点

在花粉母细胞形成期进行人工低温处理后，水稻恢复系9311对低温的反应不很敏感，在花粉可染率和自交结实率这两个指标上被处理材料与未被处理材料没有表现出明显的差异。二倍体核不育水稻培矮64s(2)则表现出一定的敏感性，因低温处理后其育性发生明显的变化，即在经过23.5℃和20.0℃的低温处理之后，其自交结实率分别为11.26%和41.44%。同源四倍体核不育水稻培矮64s(4)的育性表现则比较特殊，即在低温为23.5℃的处理中，仍然保持着稳定的雄性不育特性，其花粉可染率和自交结实率均为0，而在低温为20.0℃的处理中，其雄性不育性发生波动，其花粉可染率和自交结实率分别为42.24%和7.24%。由此可见，在经过低温处理的3份对照材料中，低温对育性影响最小的是水稻恢复系9311，其次是同源四倍体核不育水稻培矮64s(4)，受到影响最大的是二倍体核不育水稻培矮64s(2)。

在5份突变体材料中，低温对其育性的影响则因材料不同而异(表1)。在低温为23.5℃的处理中，Dwarf－P1、Short－P3和Awnless－P4仍然保持着比较稳定的雄性不育特性，其花粉可染率和自交结实率均为0。在低温为20.0℃的处理中，其雄性不育性发生波动，其花粉可染率分别为44.78%、26.90%和24.04%，其自交结实率分别为3.61%、3.54%和4.73%。另外两份突变体材料Early－P2和Ear－P5，无论是在处理Ⅰ条件下还是在处理Ⅱ条件下均表现出育性波动的特点。在处理Ⅰ条件下，其花粉可染率分别为35.23%和27.82%，其自交结实率分别为2.62%和2.21%。在处理Ⅱ条件下，其花粉可染率分别为54.71%和40.37%，其自交结实率分别为5.20%和11.58%。由此可见，经过氮离子注入处理之后，在后代群体内所出现的不同的突变单株，其雄性不育特性的表现因材料而异，某些突变体会伴随着发生形态学变异的同时也会发生相应的育性变异，而另一些突变体在发生形态学变异或生育特性变异的情况下仍然保持着其亲本的雄性不育特性。

表1　在人工低温条件下同源四倍体核不育变异株的育性表现

(www.chuimin.cn)

注:处理Ⅰ和处理Ⅱ的恒定温度分别为23.5℃和20.0℃

2.3　变异株系的主要农艺性状和育性表达特点

在试验中以各个变异单株的自交结实种子为材料分别组成M3代群体并对其主要农艺性状和育性稳定性的表现特征进行考查和鉴定。研究结果表明，在形态学上各个变异单株所组成的株系内仍然存在着一定的性状分离现象，即各个株系群体内单株之间的农艺性状并没有达到整齐一致的状态。然而，各个株系群体的变异状态存在着一定的差异，在颖壳顶端无芒变异株系和穗型变异株系内各个单株之间的性状发生分离的程度比较低，其次是剑叶长度变异群体，再其次是植株高度变异群体，在生育期变异群体内性状发生分离的程度最高。

在M3代群体内，从每一种突变体材料中分别选取3个单株进行低温处理，进而对其育性稳定性进行鉴定。研究结果表明，在5份突变体材料中，低温对其育性的影响与在M2代群体中所获得的鉴定结果比较相似。在经过低温为23.5℃的处理之后，Dwarf－P1、Short－P3和Awnless－P4仍然保持着比较稳定的雄性不育特性，其花粉可染率和自交结实率均为0，在这3种突变体的每一种突变体内，单株之间在育性表达上均不存在着明显的差异。在经过低温为20.0℃的处理之后，Dwarf－P1、Short－P3和Awnless－P4雄性不育性发生明显波动，其花粉平均可染率分别为41.81%、30.82%和26.18%，其平均自交结实率分别为4.18%、3.12%和4.66%。另外两份突变体材料Early－P2和Ear－P5，无论是在处理Ⅰ条件下还是在处理Ⅱ条件下均表现出育性波动的特点。在处理Ⅰ条件下，其花粉平均可染率分别为40.11%和30.22%，其平均自交结实率分别为3.16%和3.08%。在处理Ⅱ条件下，其花粉平均可染率分别为50.98%和39.88%，其平均自交结实率分别为4.98%和10.68%。由此可见，在M3代群体内，尽管各个株系内主要农艺性状没有达到整齐一致的程度，但各个株系在雄性不育性表达上却保持了上一个世代的突变特性，即离子束注入所导致的育性变异在M3代群体内没有发生进一步的分离。

3　讨论

通过染色体组多倍化技术和离子束生物工程技术进一步挖掘水稻杂种优势潜力的研究已经引起了一些研究者的关注^［8－9］。前人的研究结果表明，将二倍体的籼稻或粳稻分别诱导为同源四倍体之后，同源四倍体籼粳稻杂种第一代不但具有强大的杂种优势，而且其结实率和充实度都会达到正常水平，这预示着在多倍体水平开展籼粳稻杂交及其特征特性的研究可能是水稻遗传改良中新的研究热点。基于这一研究思路，不但需要对同源四倍体光温敏核不育水稻的育性稳定性和育性转换特性进行研究^［3］，而且也有必要利用现代生物技术对现有的同源四倍体光温敏核不育水稻材料进行有效的遗传改良。本试验的研究结果表明，经过氮离子束注入处理后同源四倍体材料所受到的损伤比较明显，这一研究结果与我们过去所获得的研究结果很相似^［6］。经过氮离子束注入处理后，在同源四倍体核不育水稻群体内所产生的变异效应也比较明显，在其群体内所出现的不同的突变单株，经过低温处理之后其雄性不育特性的表现因材料而异，即某些突变体会伴随着发生形态学变异的同时也会发生相应的育性变异，而另一些突变体在发生形态学变异或生育特性变异的情况下仍然保持着其亲本的雄性不育特性。

参考文献

［1］蔡得田，袁隆平，卢兴贵．二十一世纪水稻育种新战略Ⅱ．利用远缘杂交和多倍体双重优势进行超级稻育种［J］．作物学报，2001，27(1):110－116．

［2］黄群策，孙梅元，邓启云．多倍体水稻及其潜在价值［J］．杂交水稻，2001，16(1):1－3．

［3］黄群策，秦广雍，向茂成．同源四倍体水稻核不育水稻育性的初步研究［J］．作物学报，2004，30(2):183－185．

［4］余增亮．离子束生物技术引论［J］．合肥:安徽科学技术出版社，1998．

［5］黄群策，梁秋霞，李玉峰，等．低能离子注入同源四倍体水稻的生物学效应［J］．激光生物学报，2003，12(5):355－359．

［6］黄群策，孙敬三，朱生伟．种芽诱导获得同源四倍体水稻技术的研究［J］．中国农学通报，1997，13(6):21－23．

［7］黄群策，代西梅．低能氮离子对不同倍性水稻的诱变效应［J］．杂交水稻，2004，19(3):57－61．

［8］黄群策，秦广雍．离子束生物技术改良同源四倍体水稻的设想［J］．郑州大学学报，2003，35(4):31－36．

【注释】

(1)该文曾在《核技术》 ［2006，29(7):513～517］刊出