同源四倍体水稻双受精的细胞学观察，探究水稻染色体组多倍化

同源四倍体水稻双受精过程的细胞学观察⁽¹⁾

向茂成　黄群策

摘要　镜检对二倍体水稻APIV(2)和同源四倍体水稻APIV(4)的双受精过程进行了对比观察，结果表明，与二倍体水稻相比，同源四倍体水稻的双受精过程比较特殊，花粉粒在其柱头上萌发比较慢，花粉管在花柱内的伸长比较迟缓，双受精延迟，退化型胚囊的频率比较高(36.0%)，极核和反足细胞的形态异常，存在一定频率的胚自发现象。由此认为，同源四倍体水稻的有性生殖能力已经明显变弱。

关键词　同源四倍体水稻;双受精;胚囊退化;胚自发;有性生殖能力

通过无融合生殖方式固定水稻的杂种优势是我国水稻育种中最重要的育种目标之一。我国自从1979年开始在普通栽培稻的种质资源中筛选多胚苗衬料，试图从其中挖掘出无融合生殖种质，以便固定水稻的杂种优势，但收效并不很大。根据前人研究的结果，在被子植物中，无融合生殖与多倍性之间存在着明显的正相关关系，即在二倍体植物中无融合生殖现象甚为罕见，而表现无融合生殖特性的植物大部分具有多倍性^［1］。因此，试图从二倍体水稻中挖掘出无融合生殖种质资源难度比较大，而从多倍体水稻，特别是从同源四倍体水稻中寻找潜在的无融合生殖基因是一条值得探索的新途径^［2－4］。

水稻的双受精作用是重要的生殖生物学现象，是水稻生物学研究中重要的中心问题之一，是其个体发育和遗传物质传递的必经阶段。关于二倍体水稻的受精过程的细胞学观察，前人已有报道^［5－7］。但是，关于同源四倍体水稻的双受精过程，目前国内外尚未见到公开的文献报道。对二倍体水稻和同源四倍体水稻的双受精过程进行比较研究将有助于了解其生殖特性的差异，这对于从同源四倍体水稻中鉴定和筛选潜在的无融合生殖基因具有重大的现实意义。

1　材料和方法

试验中所采用的二倍体水稻APIV₍₂₎是多倍体苗品系，同源四倍体水稻APIV₍₄₎是由APIV₍₂₎经人工加倍后选育而成。试验材料于3月25日播种，采用常规的田间管理措施。7月31日至8月3日在田间取开花前1 d颖花及开花后10、30min、1.5、3.0、7.0、9.0和24.0h的颖花固定于FAA溶液中，在4℃条件下保存备用。在材料固定时，每份材料的每个时间段各取100个颖花固定。剥出每份材料的子房，利用爱氏苏木精溶液整体染色^［8］，系列乙醇脱水后用二甲苯透明和浸蜡，制成石蜡连续切片，切片的厚度为8 μm。随后，用二甲苯脱蜡，再用加拿大胶封固，最后在光学显微镜下镜检。

2　观察结果

2.1　花粉管的运动速度

关于二倍体水稻的受精过程，前人因所用材料不同而得到不同的观察结果。有些人认为，水稻传粉后1.5min花粉管已进入柱头，9h后花粉管到达珠孔端，因而，水稻的受精过程在开花后12h才能进行^［9－11］。另外一些人认为，水稻开花后30min花粉管已经到达珠孔端，个别花粉管已经进入胚囊，并释放出内含物于卵细胞的上部^［6］。

本试验的观察结果表明，在开花后10min固定的APIV₍₂₎中，可以看到花柱中包含1～3条花粉管;在开花后30min的材料中66%的花粉管已经到达

珠孔，14%的花粉管已经进入胚囊内。由此可见，APIV₍₂₎的花粉管进入柱头后的运动速度相当快，这与吴素萱和蔡起贵观察到的结果相符^［6］。

与APIV₍₂₎相比，APIV₍₄₎的花粉管在柱头上的萌发比较迟，花粉管在柱头内的伸长速度比较慢。在开花后10min的颖花中，花柱内没有检测到花粉管。在开花后1.5h的材料中，12%的花粉管已经到达珠孔;开花后3h，才有41%的花粉管进入胚囊内部。

2.2　成熟胚囊的结构状态

正常二倍体水稻的胚囊形态与发育属于蓼型。在受精前卵细胞呈卵圆形，近珠孔端略小，细胞质稀薄，液泡比较大，细胞核处于细胞的中部或稍偏上部，有一个明显的核仁，但核物质似乎很贫乏，这时的卵细胞处于有丝分裂的“静止”时期^［5－6］。水稻成熟时，卵细胞的合点端无细胞壁，细胞核居于细胞的中部，细胞器集中在核的周围，液泡分散于细胞的周边区域^［7］。

本实验的观察结果表明，在APIV₍₂₎的200个未发生受精作用的成熟胚囊中存在着正常的蓼型胚囊153个(76.5%)，退化型胚囊32个(16.0%)和变异型胚囊15个(7.5%);在15个变异型胚囊中有13个双卵卵器胚囊(86.7%)和2个三卵卵器胚囊，多卵卵器均位于珠孔端。在APIV₍₄₎未发生受精的300个成熟胚囊中包括129个正常蓼型胚囊(43.0%)，108个退化型胚囊(36．0%)和63个变异型胚囊(21.0%);在变异型胚囊中发现45个二卵卵器胚囊(71．4%)，11个三卵卵器胚囊(17.5%)和7个无助细胞胚囊(11.1%)。在观察中发现，正常蓼型胚囊在形态上表现为细胞轮廓清楚，内部结构完整或比较完整，各部位的染色程度有明显的差异，反足细胞、中央细胞、助细胞和卵细胞各自都位于蓼型胚囊的固定位置上;退化型胚囊在形态上的特点表现为细胞轮廓不清，内部结构没有明显差异，各部位的染色均比较深。

本实验的观察结果表明，在APIV₍₂₎的200个未发生受精作用的成熟胚囊中存在着正常的蓼型胚囊153个(76.5%)，退化型胚囊32个(16.0%)和变异型胚囊15个(7.5%);在15个变异型胚囊中有13个双卵卵器胚囊(86.7%)和2个三卵卵器胚囊，多卵卵器均位于珠孔端。在APIV₍₄₎未发生受精的300个成熟胚囊中包括129个正常蓼型胚囊(43.0%)，108个退化型胚囊(36.0%)和63个变异型胚囊(21.0%);在变异型胚囊中发现45个二卵卵器胚囊(71.4%)，11个三卵卵器胚囊(17.5%)和7个无助细胞胚囊(11.1%)。在观察中发现，正常蓼型胚囊在形态上表现为细胞轮廓清楚，内部结构完整或比较完整，各部位的染色程度有明显的差异，反足细胞、中央细胞、助细胞和卵细胞各自都位于蓼型胚囊的固定位置上;退化型胚囊在形态上的特点表现为细胞轮廓不清，内部结构没有明显差异，各部位的染色均比较深。

在正常二倍体水稻的成熟胚囊内助细胞之一退化比较早，另一助细胞一般呈逐渐消失的状态。在APIV₍₂₎的153个正常蓼型胚囊内，受精前只有一个助细胞被保留，另一个助细胞已发生退化。但是，APIV₍₄₎的助细胞在成熟胚囊内的存在时间比较长，其细胞核比较小，染色比较淡，其合点端比较尖，而其珠孔端比较宽;在受精前的300个成熟胚囊内有7个无助细胞(2.3%)，76个只包含一个助细胞(25.3%)，109个包含有双助细胞(36.3%)，另外的108个退化型胚囊内没有观察到具体的结果。

在发生受精之前，APIV₍₂₎的两个紧密相贴的极核已经移至卵细胞的合点端附近，这对于随后与精子接触很有利。在每一个极核内包含有一个大而显著的核仁，在核腔中有少量染色质颗粒和染色丝;在极核外有稠密的细胞质。在APIV₍₄₎的成熟胚囊中，在60%胚囊内极核已经通过两个极核的融合而产生次生极核，在每一个次生极核内包含有一个大而显著的核仁;在20%胚囊内观察到在靠近卵细胞合点端保持着3个染色深的大极核;极核在胚囊内的位置有明显的变化，大部分位于胚囊的中部，有些靠近卵细胞的合点端，还在个别胚囊内观察到极核位于合点处，与反足细胞团在一起。

在正常的二倍体水稻中，反足细胞的细胞核和细胞质染色很深，其形态多种多样。最初形成的3个反足细胞通过有丝分裂和无丝分裂后形成多细胞结构，在某些细胞内具有多核，而在每一个细胞核中又包含有比较多的核仁。与APIV₍₂₎比，APIV₍₄₎的反足细胞有其特点，即某些反足细胞能形成具有胚柄和胚形态的拟胚结构，这种拟胚结构的位置不定，可能在合点处，也可能在珠孔端，还可能位于胚囊的中部;还有一些反足细胞通过分裂后将卵细胞围住并将其限制在珠孔端的小区域内。

在APIV₍₄₎的胚囊内发现了胚自发现象。在没有发生受精、卵细胞和极核存在时，在珠孔端卵细胞旁边就存在着包含4～8个细胞的球形胚，这是由多卵卵器中的一个卵细胞或助细胞之一通过自发分裂后形成的。在对APIV₍₄₎的300个成熟胚囊进行观察时发现有15个胚囊内已经包含有球形胚(5.0%)。

2.3　精卵结合的动态

开花后30min，APIV₍₂₎的大部分花粉管已经到达珠孔，少部分花粉管从退化助细胞的位置进入胚囊，2个精子从花粉管内释放出来，在卵细胞附近的精子内有染色深的颗粒。在开花后1.5h固定的材料中可以看到精子已经进入卵细胞并靠近卵细胞核的核膜旁边。在开花后7h固定的材料中有65%的卵细胞已经完成了两性融合，由此形成只具有一个核仁的合子。60%的受精卵发生第1次分裂的时间在开花后9h。在本试验中关于APIV₍₂₎精卵结合动态的观察结果与前人的结果一样^［6］。

APIV₍₄₎的情况比较特殊。APIV₍₄₎的花粉管进入花柱和胚囊的时间比较晚。开花后3h，有部分花粉管从珠孔端进入胚囊。与APIV₍₂₎相比，APIV₍₄₎的花粉管比较粗，其内的精子比较大，精子内的颗粒染色比较深。在开花后7h固定的材料中，在36%的胚囊内可以见到精子已经进入卵细胞核，这些精子主要靠在卵细胞核的核膜处。在开花后9h才有10%的卵细胞核完成了与精子的融合，由此形成具有一个核仁的合子。在开花后24h的胚囊内，还有许多卵细胞(63%)的核没有与精子融合，这时的精子正停留在卵细胞核的核膜外边。有少部分合子(15%)在开花后24h才进行第1次有丝分裂。(www.chuimin.cn)

2.4　极核与精核的结合动态

在APIV₍₂₎成熟胚囊中，两个紧密相贴的极核已经转移到卵细胞近合点端。在开花后1.5h，从30%的固定材料中观察到精子接触到极核之一的核膜。此时，在极核中有比较明显的染色颗粒和丝状结构。在开花后3h的材料中，可以观察到30%的材料已经完成雄性核仁与极核核仁的融合过程，有15%的材料已经完成了与雄性核融合的极核又与另一极核融合，由此成为初生胚乳核。在开花后9h固定的材料中观察到初生胚乳核进行第1次有丝分裂。

在APIV₍₄₎的成熟胚囊内，部分极核已融合为次生极核，它们位于卵细胞近合点端的细胞膜旁边。在开花后7h固定的材料中，在36%的胚囊内可以见到精子已经进入极核细胞内，这些精子主要位于极核的细胞质中。开花后9h，在15%材料中观察到极核与精子融合，由此产生初生胚乳核。在开花后24h的材料中才有5%胚囊内的初生胚乳核开始第1次分裂。除此之外，在部分胚囊(6%)中发现，当合子发生第1次分裂后形成二细胞结构时极核仍然成单存在，这很可能是卵细胞发生了受精作用而极核没有发生受精或受精极核发育异常的结果。

3　讨论

与二倍体水稻相比，同源四倍体水稻的生殖性状比较特殊。同源四倍体水稻结实率比较低是影响其实用价值的主要原因。前人针对同源四倍体水稻结实率大幅度下降的原因进行过研究。鲍文奎等(1956)认为由于养料转移和供应不正常的生理因素和同质结合的遗传因素是同源四倍体水稻结实率低的原因。Masima等(1981)指出，同源四倍体水稻育性降低的原因，估计有15%～20%由配子不育造成，15%由环境造成，50%由合子不育而造成。宋文昌等(1992)认为，当细胞内存在4个相同的染色体组时，细胞核与细胞质的比例关系发生了变化，染色体的不均衡分配，基因的剂量效应和基因的互作等破坏了原有的遗传平衡，使生理功能失调，最终导致结实率下降^［12］。

从本实验的观察结果来看，同源四倍体水稻APIV₍₄₎的双受精过程比较特殊。从时间上来看，花粉粒在其柱头上萌发比较慢，花粉管在花柱内的伸长比较迟缓，花粉管进入胚囊、精卵结合、精子与极核结合、合子和初生胚乳核的第1次分裂的时间都比正常二倍体水稻延迟。从形态上来看，退化型胚囊的频率比较高(36.0%)，极核和反足细胞的形态异常，存在着一定频率的胚自发现象，在某些胚囊内发现合子发生分裂而极核不分化的现象。由此可见，APIV₍₄₎在双受精过程中所表现的特异性是其有性生殖能力变弱的重要标志之一。我们认为，同源四倍体水稻的有性生殖能力变弱将为潜在的无融合生殖基因的表达创造有利的内部环境^{［13－14］}。在本试验中所观察到的胚自发现象就是单倍性无融合生殖现象。由此推测，在多倍性水稻中通过对其生殖特性进行研究有可能寻找到一些潜在的无融合生殖种质资源，因为多倍性水稻由于其染色体组的倍增而打破了原有的遗传平衡关系，由此伴随着其有性生殖能力的降低，这对于某些潜在无融合生殖基因的表达非常有利。因此，在同源四倍体水稻中筛选潜在的无融合生殖基因可能比在二倍体水稻中更容易成功。

参考文献

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【注释】

(1)该文曾在《杂交水稻》 ［2002，17(4):53～55］刊出