水稻染色体组多倍化研究揭示双胚苗种子的电镜观察结果

双胚苗水稻种子的扫描电镜观察⁽¹⁾

黄雅琴　黄群策　燕晓阳

摘要　以同源四倍体双胚苗水稻品系(D07－04－01)及其衍生后代(01－04－01，D07－02－01，DP07－04－01)为研究材料，利用扫描电镜技术和X射线衍射技术对稻米的垩白性状淀粉粒的形态特征和淀粉的晶体特性进行了初步研究。研究结果表明，与其他材料相比，双胚苗二倍体品系D07－02－01的垩白粒率、垩白度和垩白大小均最小，稻米的自然横断面中部无明显辐射状，裂痕少且浅，“粗短形”的不规则多边形胚乳细胞与淀粉粒分布均匀，多面体状淀粉粒呈现典型的晶体结构，数目多且排列致密，球形单粒淀粉粒和块状不规则的复粒淀粉体数目比较少，相对结晶度高，直链淀粉含量低，即外观品质和食味品质均比其他四倍体品系好。

关键词　双胚苗水稻;同源四倍体;米质;淀粉粒;扫描电镜; X射线衍射仪

水稻是世界上最主要的粮食作物，选育高产、优质、多抗统一的水稻新品种是21世纪的育种目标^［1］。近年来的研究结果表明，同源四倍体水稻具有生长势强、生物学产量高、籽粒大、抗逆性强以及特殊的生殖发育特性等特点，这已引起一些水稻研究者的关注^［2，3］。根据离子束生物技术的特殊性和实用性，本文以低能氮离子束为诱变源，对同源四倍体水稻进行诱变处理，在其后代群体内筛选到具有双胚苗特征的新材料^［4］，这一新材料的米质如何值得关注。然而，目前关于同源四倍体水稻米质性状方面的研究报道较少，国内外的研究主要是以普通二倍体水稻为材料^［5］，因此，本试验对1个同源四倍体双胚苗突变水稻材料及其2个近亲系，1个介导品系材料的稻米品质进行了初步研究，旨在为进一步认识同源四倍体水稻的米质性状提供参考资料。

1　材料与方法

1.1　试验材料

本研究所用材料为同源四倍体双胚苗突变水稻材料D07－04－01，其近亲系D07－02－01和01－04－01，及介导品系DP07－04－01、D07－02－01是以D07－04－01的花粉材料通过花药培养途径所获得的稳定的二倍体后代株系; 01－04－01是四倍体原始亲本，由它通过离子注入后筛选到具有双胚苗特征的D07－04－01;以D07－04－01为受体，披碱草总DNA为供体在离子束的介导下转基因，在后代群体内筛选到四倍体突变单株DP07－04－01。

1.2　试验方法

1.2.1　稻米垩白性状的测定

按照国家标准GB/T 17891—1999进行测定。每份材料均从精米试样中随机数取整精米100粒，拣出有垩白的米粒，重复2次，2次测定的平均值，即为垩白粒率;从精米试样中随机数取整精米100粒，平放扫描后用垩白分析软件chalkiness1.0进行垩白度的测定，重复2次;垩白大小=垩白度/垩白粒率。

1.2.2　淀粉粒的显微观察

每份试验材料均从精米试样中随机取3粒，在背腹径最大处用手掰断，切下断裂面，厚度1～2mm，此即样品，令自然断裂面朝上，切割面朝下，用导电胶粘着于铜样台上，于JFC－1600AUTO FINE COATER上喷镀黄金，喷镀条件I =20mA，t =3min，最后置于JSM－6700F型扫描电镜下观察米粒断面的腹部，中部和背部并拍照，加速电压10 kV。

1.2.3　淀粉晶体的X射线衍射分析

每个试验材料均从精米试样中随机取20粒，于研钵中研磨成粉状，使用PANalytical公司生产的X'Pert PRO型X射线衍射仪对样品米粉进行扫描分析。本仪器采用Cu靶并进行连续扫描，发射波长为1.54，衍射角2的范围为5°～40°，步长0.02°/步，速度0.14°/s，用时共计4分29秒淀粉相对结晶度采用X＇PerthighScore Plus软件计算，XRD衍射图谱使用Origin7.5软件绘制。

2　结果与分析

2.1　稻米垩白性状的测定

垩白是胚乳中白色不透明部分的总称，是因淀粉与蛋白质颗粒填塞疏松，颗粒间充气，光线因不能通过而折射产生，按其在胚乳中所处的位置分为腹白、背白与心白、无垩白的半透明胚乳，是优质米必须具备的条件。对4个供试水稻品系的垩白粒率、垩白度和垩白大小进行测定结果如表1所示，由表1可知，01－04－01的垩白性状最差，D07－02－01的垩白性状最好。

表1　4份水稻材料的垩白性状

2.2　扫描电镜的观察结果

2.2.1　横断面的观察

在扫描电镜下，放大100倍观察4个水稻品系的最大自然横断面，其胚乳细胞排列方式及形态见图1根据横断面中部是否向外呈辐射状，以及辐射状的明显程度，将观察结果分为3种其一是从稻米的横断面中心向外呈明显辐射状，属于这种情况的品系是D01－04－01(图1－3)和DP07－04－01(图1－4)，构成辐射状形态的是数层“细长形”的长方柱状胚乳细胞，它们形态不一，大小不等，在这些长方柱状胚乳细胞间有小面积的淀粉粒分布;其二是从稻米的横断面中心向外辐射状不明显甚至几乎看不到辐射状，属于这种情况的品系是D07－02－01(图1－2)“粗短形”的不规则多边形胚乳细胞与淀粉粒均匀地分布在整个横断面上;其三是介于前两者之间，在稻米的横断面中心，部分区域可见向外呈明显辐射状，其余区域辐射状不明显，属于这种情况的品系是D07－04－01(图1－1)，构成辐射状形态的是数层“细长形”的长方柱状胚乳细胞，无辐射状的其余区域是致密的淀粉粒，其间夹杂着极少数目的“粗短形”不规则多边形胚乳细胞。

图1　种子横断面中部的扫横电镜观察

在横断面中部除能观察到上述现象外，还能观察到裂痕，但不同品系间存在差异，裂痕有多，有少，有深，有浅。由图1可见，D07－04－01、01－04－01和DP07－04－01的横断面上都有2条裂痕，一深一浅; D07－02－01上虽然也有2条裂痕，但都较短浅。推测裂痕可能是在人为施加外力制造自然横断面时产生的，如果淀粉粒排列疏松，间隙大，裂痕就容易出现且较深、较多;如果淀粉粒排列紧密，裂痕就不容易出现且较浅、较少。因此，裂痕的特征也可间接反映淀粉粒的排列情况，从而辅助米质优劣的判定。

结合垩白性状的测定结果，上述观察说明，中心辐射状的明显程度、胚乳细胞的形状、其与淀粉粒在横断面上的排列方式、裂痕的特征等与垩白发生几率有一定的相关性。中部辐射状越不明显，“粗短形”的不规则多边形胚乳细胞比“细长形”的长方柱状胚乳细胞越多胚乳细胞与淀粉粒在横断面上分布越均匀，裂痕越浅、越少，则垩白越不容易发生，稻米品质越优。

2.2.2　淀粉粒的观察

在扫描电镜下，放大2 000倍观察4个水稻品系的腹部、中部和背部，淀粉粒的形态见图2，其中图2－1的发育最差，图2－8的发育最好，从图2－1至图2－8发育程度依次递优，图2－9示蛋白质颗粒富集区D07－04－01腹部(图2－3)淀粉体形状不规则，排列疏松，少数直径2～3 μm的球形单粒淀粉游离其间;中部(图2－7)部分区域淀粉粒排列致密，呈现典型的多面体晶体结构，其间游离着直径约3 μm的球形单粒淀粉，裂痕处2侧的淀粉体(图2－5)体积大，形状不规则，有一定的棱角;背部(图2－8)淀粉体棱角清晰，形状规则，排列致密，呈现典型的多面体晶体结构，出现空腔，空腔的直径约4 μm D07－02－01腹部(图2－6)游离着少数的球形单粒淀粉，复粒淀粉粒形状大小不一，极不规则，但在边缘呈现棱角，在小面积的区域内能够看到具有典型的多面体晶体结构的淀粉粒;中部淀粉粒排列致密，形状规则，呈典型的多面体晶体结构，球形单粒淀粉很少;背部淀粉体分布均匀，棱角清晰，形状规则，排列致密，呈典型的多面体晶体结构，中部与背部差异不明显01－04－01腹部(图2－1)以球形单粒淀粉粒为主，在无淀粉粒的区域，胚乳细胞群无形态，轮廓不清晰;中部(图2－2)不仅能观察到球形单粒淀粉，也能观察到球形的复粒淀粉体，在无淀粉粒的区域是胚乳细胞群，胚乳细胞轮廓模糊，有的细胞中开始有淀粉粒的沉积;背部(图2－9)淀粉体无固定形态，排列疏松，间隙大，偶尔能观察到小面积的多面体晶体结构，在淀粉粒间隙分布有很少的球形单粒淀粉粒和蛋白质颗粒，它们都呈现球形，单粒淀粉粒的直径2～3 μm，蛋白质颗粒的直径较小，约1 μm，DP07－04－01腹部游离着单粒淀粉粒，也能见到数目不多的球形复粒淀粉粒，淀粉粒体积大，形状不规则，排列疏松;中部(图2－4)淀粉粒充实度差，呈现块状不规则状，间隙大，球形单粒淀粉粒少;背部淀粉粒以复粒淀粉粒为主，但与中部相比，不规则块状的淀粉体体积变小，具有一定的棱角，部分区域能观察到致密的呈典型多面体晶体结构的淀粉粒。

结合垩白性状的测定结果，上述观察说明，淀粉粒的形态和分布特征与垩白发生几率有一定的相关性胚乳细胞发育不良，淀粉积累不充分，球形单粒淀粉粒和块状不规则的淀粉体数目多，排列疏松间隙大，则垩白容易发生;球形单粒淀粉粒和块状不规则的复粒淀粉体数目少或无，多面体状淀粉粒呈现典型的晶体结构，数目多且排列致密，形成空腔，则无垩白发生。裂痕两侧的淀粉粒形状不规则，排列疏松，证明了观察横断面时的推测是合理的，即有垩白的区域淀粉粒分布疏松，容易断裂。这一结果也印证了垩白形成的原因，当胚乳细胞内淀粉体处于发育期间，发育不完全，多为椭圆形，大小差异较大，排列疏松，粒间空隙大，颗粒间充气，光线不能通过，发生了折射，形成了垩白;当胚乳、细胞内淀粉体发育成熟，淀粉粒得到了充分的积累，充满了整个胚乳细胞，其间隙消失，淀粉体和其间的淀粉粒因相互挤压而成为多面体型，它们大小较为一致，排列紧密，粒间空隙小，稻米外观上呈玻璃质透明，品质较好。(www.chuimin.cn)

图2　淀粉粒的扫描电镜观察

2.3　淀粉晶体的X射线衍射分析

4个供试水稻品系淀粉晶体的XRD衍射图谱如图3所示，它们均表现为典型的A型淀粉晶体^［6］，且均有5个较明显的峰，其中第一峰、第三峰和第五峰尖峰强度强，而第二峰和第四峰较弱从表2所示的5个峰的特征值可以看出，衍射峰主要集中在15°～24°之间，当衍射角分别约为15°、17°、18°和20°时，4个水稻品系的衍射强度分别为4373～4447 CPS、5365～5438CPS、5692～5799 CPS和4862～5031CPS，且4个品系间差异不明显;当衍射角约为23°时，D07－02－01的衍射强度为5242CPS，明显低于其他3个品系(5643～5746CPS)，这是由淀粉晶体本身的物理特性决定的。相对结晶度是反映稻米淀粉结晶程度的一个重要指标，用晶体区的面积与晶体区和非晶体区的面积和之比表示4个品系中，D07－02－01的相对结晶度最高，达10.94%; D07－04－01的相对结晶度最低，仅6.79%(表2)在稻米淀粉颗粒中，直链淀粉不能形成结晶，而是以单螺旋结构渗入到支链淀粉分子中，形成疏密相间的晶体区和非晶体区，淀粉粒的晶体区主要由支链淀粉链外部的短链部分组成。前人的研究结果认为直链淀粉含量与相对结晶度之间呈显著负相关^［7］，可能是在支链淀粉含量不变的前提下，直链淀粉含量的降低，减少了非晶体区的面积，导致淀粉相对结晶度的升高。稻米品质与直链淀粉含量存在密切关系，总的来说，直链淀粉含量越高，米饭质地越硬，直链淀粉含量越低，米饭质地越软。由此可见D07－02－01相对结晶度高，直链淀粉含量低，适口性好，食味品质优良。

表2　淀粉X射线衍射图谱特征值

图3　淀粉晶体的XBD衍射图谱

3　讨论

20世纪80年代中期，我国发现和挖掘的离子束生物技术在创造生物体遗传性变异群体方面具有新颖性和实用价值，已有的研究结果表明，同源四倍体水稻比二倍体水稻对低能氮离子束注入处理更敏感，且群体内变异频率更高，在其后代群体中筛选到了具有双胚苗性状的新材料^［8］。本研究以同源四倍体双胚苗水稻品系及其衍生后代为研究材料，通过对垩白性状的测定、稻米横断面与淀粉粒的显微观察以及淀粉晶体的X射线衍射分析，认为3个同源四倍体水稻品系的垩白性状都明显劣于二倍体水稻品系，米粒横断面上都有不同程度的辐射状和裂痕，腹部和中部的淀粉粒发育比背部发育差，胚乳细胞发育不良，淀粉积累不充分，球形单粒淀粉粒和块状不规则的淀粉体数目多，排列疏松间隙大，而二倍体水稻品系的米粒横断面上没有辐射状，裂痕少且浅，各部位的淀粉粒整体发育较好，球形单粒淀粉粒和块状不规则的复粒淀粉体数目少或无，多面体状淀粉粒呈现典型的晶体结构，数目多且排列致密，形成空腔，外观上呈玻璃质透明。同源四倍体水稻与二倍体水稻一样均为A型淀粉晶体，不存在差异。通过对相对结晶度的比较认为本试验中研究的3个同源四倍体水稻的直链淀粉含量都比二倍体要高，在宋文昌等^［9］分析的59对样品中，四倍体直链淀粉含量比二倍体降低的有54对，占品种总数的91.5%，增加的有5个品种，可见直链淀粉含量的高低在品系间存在着差异总之，二倍体水稻D07－02－01的外观品质和食味品质均比较好。

同源四倍体水稻结实率低，因此其生殖特性一直是人们关注的热点^{［10－12］}在米质方面，前人仅对直链淀粉和支链淀粉含量、氨基酸含量、胚乳蛋白中的清球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量进行过研究^［9，13］，在垩白性状、淀粉粒的显微观察和淀粉晶体的X射线衍射分析方面本试验尚属首次。造成同源四倍体水稻品质较差的原因可能是，与二倍体水稻相比，同源四倍体水稻生长发育慢，开花成熟较迟，在抽穗期和灌浆期气温下降，而结实期气温以21～26℃为宜，过低的温度影响了淀粉合成酶的活性，使稻米不能正常灌浆充实，胚乳细胞分裂受阻，淀粉体发育异常，单粒淀粉多，复粒淀粉少，淀粉粒间间隙增大，且排列疏松，垩白增大，青米率增加，稻米品质下降^{［14，15］}。多胚苗水稻是一个特殊的种质资源，它将为挖掘同源四倍体水稻的潜在利用价值寻找到一个新的突破口。

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【注释】

(1)该文曾在《核农学报》 ［2010，24(6):662～667］刊出