激光共聚焦显微技术观察同源四倍体双胚苗

利用激光扫描共聚焦显微技术观察同源四倍体 双胚苗水稻的胚胎学特征⁽¹⁾

黄群策　代西梅　贾宏汝

摘要　利用激光扫描共聚焦显微技术对同源四倍体双胚苗水稻的受精过程、胚胎发育过程和双胚来源进行了观察鉴定。研究结果表明，同源四倍体水稻和二倍体水稻在发生受精作用的时间上没有存在着很大的差异。双胚苗水稻的受精作用和胚胎发育表现出明显的特异性，其双胚苗性状有其胚胎学根源，双胚可能有4种来源，即来源于由双套胚囊形成的双胚、由多卵卵器中的卵细胞和类卵细胞分别通过受精作用形成双胚、由特异性的反足细胞通过异常发育后形成额外的幼胚、由胚乳细胞通过异常发育后形成胚乳型幼胚。通过对试验材料的受精频率及其结实率进行比较后发现，双胚苗水稻具有更弱的有性生殖能力，其遗传可塑性更强，这为离子束介导技术的研究找到了比较好的受体材料。

关键词　同源多倍体;双胚苗水稻;胚胎学特征

利用无融合生殖种质及其生殖方式固定水稻杂种优势的研究在国内曾一度引起了一些研究者的高度关注，其技术思路主要是在二倍体水平通过寻找多胚苗水稻新种质，进而获得具有无融合生殖特性的基因资源^［1］。然而，在禾本科植物的无融合生殖种质资源中，其表现特点之一就是无融合生殖性状的表达需要染色体组多倍化的遗传背景作为基础，即染色体组多倍化有助于无融合生殖性状的表达^［2］。

同源四倍体水稻在生殖特性上表现出一定的特异性，其研究价值和潜在的利用价值有待于进一步探索^［3］。关于同源四倍体水稻的生殖发育特性，前人已经开展过一些研究并获得了一些有一定学术价值的研究结果^［4－6］。我们以低能氮离子束为诱变源，对同源四倍体水稻进行注入后在其后代群体内已经筛选到具有双胚苗特征的突变体材料，经过多代纯化和筛选之后已经获得了遗传上稳定的株系。对于同源四倍体双胚苗水稻材料的生殖发育特性值得进一步研究。本项研究利用激光扫描共聚焦显微技术对同源四倍体双胚苗水稻的受精过程、胚胎发育过程和双胚来源进行了观察鉴定，旨在研究其生殖发育特性并寻找双胚苗发生的胚胎学证据。

1　材料与方法

在试验中采用3份试验材料，即同源四倍体双胚苗水稻品系ASDOR05－01、同源四倍体水稻品系99－01(4)和二倍体水稻品系99－01(2)。在此之前，以二倍体水稻品系99－01(2)为材料，通过种芽诱导法获得了同源四倍体水稻品系99－01(4) ^［5］。随后，以同源四倍体水稻品系99－01(4)为材料利用低能氮离子束注入后经过多代筛选，获得了同源四倍体双胚苗水稻品系ASDOR05－01^［6］。

在试验中参照前人的研究方法^［7，8］，我们利用核荧光染色技术和子房整体透明技术对试验材料的受精过程及其胚胎发育过程进行了比较观察。在各份试验材料开花前1 d，开花后0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、12h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d分别取颖花并将其固定和保存于FAA固定液中。试验材料的每个发育时期分别取50个颖花作为鉴定材料。在观察鉴定之前利用70%的酒精将其冲洗一下，然后在解剖镜下从中分离出子房并将其保存于70%酒精中备用。在对试验材料进行染色之前，试验材料经过浓度分别为50%、30%、15%的乙醇处理后将其放入蒸馏水中，每次处理的时间为20min。接着，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液对其进行1h软化处理，蒸馏水冲洗几次后再利用pH值为8.2的磷酸盐缓冲液进行2h预处理，随后利用0.005%水溶性苯胺蓝溶液对其进行2h染色。利用蒸馏水对试验材料冲洗2～3次，再用1 μg/mL的DAPI溶液染色12h。利用蒸馏水对其冲洗2～3次后，进行乙醇梯度(15%、30%、50%、70%、85%、95%)脱水，每一级的脱水时间为20min。过后，将子房放入无水乙醇中脱水两次，每一次的脱水时间为2h，最后将其转入无水乙醇中过夜备用。第2天将已经脱水的试验材料在无水乙醇和水杨酸甲酯(1∶1)组成的混合液中过渡1h，再利用水杨酸甲酯对其进行3次透明处理。在前2次透明处理时，每一次的处理时间为2h，最后一次透明处理的时间为15h。试验材料经过水杨酸甲酯透明处理后可以在水杨酸甲酯中保存备用。

在对试验材料进行观察鉴定之前，利用镊子轻轻将处理好的子房夹出，将其置于凹玻片上，用丁香油封片。将制备好的载玻片倒置于Leica SP2激光共聚焦扫描显微镜上，利用488nm波长的激光对其进行激发扫描，由此获得试验材料在各个发育时期的扫描图片。利用Leica相关软件系统对系列扫描图片进行3D重建。在试验中，对于经过受精后已经发育成形态比较大的试验材料，可以直接将其放置在与激光扫描共聚焦显微镜相配套的小培养皿中，利用同样的观察鉴定方法进行激光扫描扫描处理。通过对来自各份试验材料的扫描图像资料进行比较分析后确定各份试验材料在生殖发育上的特异性并寻找出同源四倍体双胚苗水稻品系产生双胚苗的胚胎学证据。

在对试验材料的受精频率及其特异性进行观察鉴定的同时，在盆栽条件下通过套袋隔离后对各份试验材料的自交结实状况进行统计分析，由此获得其结实率资料。通过对各份试验材料的受精频率与其结实率的相关性进行比较分析，探讨双胚苗水稻的潜在利用价值。

2　结果与分析

2.1　试验材料正常的发育特征

在试验中发现，3份试验材料［即同源四倍体双胚苗水稻品系ASDOR05－01、同源四倍体水稻品系99－01(4)和二倍体水稻品系99－01(2)］的双受精过程基本相同。开花后花粉粒落在羽毛状的柱头上之后很快就会生长出花粉管，花粉管经过花柱组织而进入子房腔内。然后，花粉管顶端经过胚珠的珠孔端而进入胚囊内，在退化助细胞的位置释放出两个精子。一个精子与卵细胞融合后形成合子，由合子进一步发育成幼胚。另一个精子与极核融合后形成初生胚乳核，由初生胚乳核进一步发育成胚乳。观察结果表明，ASDOR05－01的受精作用属于有丝分裂前的配子融合类型。精子核与极核的融合过程类似于精子核与卵细胞的融合过程，但是前者的融合速度比后者的融合速度要快。精子核与极核发生融合后所形成的初生胚乳核不经过静止期而直接进入分裂状态，而精子核与卵细胞核发生融合后所形成的合子通常要经过几个小时的静止期后才启动第一次有丝分裂过程。ASDOR05－01正常幼胚的发育类型为紫菀型，胚乳的发育类型为核型胚乳(表1)。

表1　ASDOR05－01正常的发育特征

在以ASDOR05－01为材料的试验中对其精卵融合、幼胚的形成和幼胚的发育进行了观察。在开花后0.5h花粉粒在柱头上萌发，由此形成花粉管。随后，营养细胞核和生殖细胞核依次进入花粉管。花粉管形成之后伸入柱头组织并在柱头组织内不断伸长。在开花后1h，在花柱组织内可以见到携带有生殖核的花粉管。在开花后1～2h，花粉管经过珠孔端进入胚囊内，在此时尚未观察到花粉管内的2个精子被释放到胚囊内。在开花后2h，花粉管在退化助细胞的位置释放出两个精子以及其他一些内含物。在此之前，另一个助细胞也呈现出逐渐退化的状态，由其内的肌动蛋白形成两个冠状结构。冠状结构始于退化助细胞的基端，一条在极核的位置终止而另一条在卵细胞的位置终止。形成的肌动蛋白冠与精子表面的肌球蛋白相互作用，引导精子核分别进入中央细胞和卵细胞内。进入卵细胞的精子核慢慢地移动到卵细胞核的位置。在开花后4h左右，可以观察到精子核紧贴在卵细胞核之上，其内容物慢慢地进入卵细胞核内。随后，在卵细胞核内出现1～2个雄性核仁。在开花后6h，在卵细胞核内的雌性核仁与雄性核仁仍然没有发生融合，而在此时在中央细胞内极核已经与精核完成了受精作用，由此形成的初生胚乳核已经发生1～2次分裂。在开花后12h，在卵细胞核内的雌性核仁与雄性核仁才完成融合，由此形成一个合子。在合子内只有一个比较大的核仁，在其核周围由浓厚的细胞质围绕着。雄性核仁与雌性核仁的融合作用通常发生在合子发生分裂之前，合子以一个大核仁的形式进入分裂期。合子形成之后通常有几个小时的静止期，然后才进行第一次有丝分裂。在开花后1 d，合子已经发生1～2次分裂，由此形成2细胞原胚或4细胞原胚。在大多数试验材料中合子的第一次分裂表现为横向分裂，由此形成顶端细胞和基细胞。在通常情况下，通过第一次分裂所形成的两个细胞在形态上表现出一定的差异，即顶端细胞比基细胞稍大一些，前者的细胞质比较浓厚。在少数试验材料中合子的第一次分裂也表现为纵向分裂。在开花后2 d，由二细胞原胚已经发育成球形胚，此时的球形胚由8～16个细胞组成。在开花后3 d，由球形胚逐渐发育成梨形胚。在开花后5 d，幼胚开始分化出胚芽鞘原基。在开花后7 d，成熟胚的形态已经基本形成，其中包括盾片、胚芽、胚根鞘和胚根等。

在以ASDOR05－01为材料的试验中对其极核发生受精作用以及胚乳的发育状态进行了观察。观察结果表明，极核的受精过程与卵细胞的受精过程很类似，只是极核与精子的融合速度比卵细胞核与精子的融合速度要快得多。在开花后3h，可以观察到精子核首先与1个极核的核膜接触，由此发生核膜的融合。随后，精子核的染色质向极核内分散，在极核内出现1个小的雄性核仁。雄性核仁会慢慢变大，最后增大至与极核的核仁差不多的大小。在开花后4h，在大多数材料中观察到1个精子核先与1个极核完成融合作用后形成融合体，融合体再与另1个极核发生融合，由此形成初生胚乳核。在初生胚乳核发生分裂之前，其内的核仁一直保持不融合状态。在少数试验材料中可以观察到2个极核首先发生融合后形成次生极核，然后由次生极核再与精子核发生融合作用。初生胚乳核形成之后很快就会进行分裂。在开花后5h，可以观察到初生胚乳核已经发生有丝分裂。通过第一次分裂之后形成2个游离的胚乳核，在游离核内通常携带着1～4个核仁。初生胚乳核发生分裂则标志着胚乳的形成和发育已经启动。从时间上来看，在同一胚囊内初生胚乳核发生分裂的时间总是先于合子发生分裂的时间。当合子进入第一次有丝分裂中期时，在胚囊内可以观察到初生胚乳核已经发生了3次分裂，由此形成8个游离核。在开花后1 d，在大多数试验材料的胚囊内已经形成16个或更多的游离核，形成的游离核围绕着胚囊的周缘分布。在开花后2 d，在胚囊内已经形成比较多的游离核，围绕胚囊周缘分布的游离核达到1～2层。在此时，在大多数胚囊内的合点端仍然可以观察到反足细胞团的存在，但从其形态上来看反足细胞团已经呈现出开始解体的状态。在开花后3 d，在每个游离胚乳核之间通过自由生长壁的形式开始形成细胞壁，由此导致以胚乳游离核为基础逐渐形成胚乳细胞。在此时，在大多数试验材料中反足细胞团已经完全解体消失，珠心组织也开始解体，胚囊的形态逐渐变大。在开花后5 d，在整个胚囊胚内已经被胚乳细胞所充满，胚囊的体积也进一步扩大。在胚乳细胞内开始出现淀粉等内容物的积累。在开花后7 d，胚乳组织基本形成，在胚乳细胞内已经积累了比较多的代谢物质，在激光扫描共聚焦显微镜下已经看不清胚乳细胞的内部结构。

2.2　试验材料异常的发育特征

在试验中对3份试验材料的双受精过程及其胚胎发育特征进行观察后所获得的结果表明，在每一份试验材料中都存在着异常的发育现象，但在同源四倍体双胚苗水稻品系ASDOR05－01中异常发育类型的数量更多、特异性更加明显。对ASDOR05－01植株开花后3～7 d共计150个胚囊进行观察的结果表明，其中发生正常双受精的胚囊数为80个，其频率为53.33%;败育胚囊数或发生异常受精的胚囊数共计70个，其频率为46．67%。发生胚囊败育或异常受精的情况主要包括9种类型。其一是有8个子房(5．33%)内的胚囊细胞发生纤维化作用，其细胞壁在激光共聚焦显微镜下显示出比较强烈的荧光。其二是有28个胚囊(18.67%)在发生受精作用的过程中出现退化现象，最后导致在胚囊的位置只剩下一条缝隙或充满珠心组织。其三是在9个胚囊(6.00%)内只存在着卵细胞的单受精作用。位于珠孔端的卵细胞与精子核能进行正常的受精作用，而位于合点端靠近反足细胞团位置的极核不能与精子核发生正常的受精作用，由此导致在胚囊内可以观察到幼胚的发育而不能观察到游离胚乳核或胚乳细胞的形成。其四是在7个胚囊(4.67%)内极核与精子核发生单受精作用，而卵细胞不能与精子核发生正常的受精作用，由此导致在胚囊内只存在着初生胚乳核或胚乳细胞而不能观察到幼胚的发育。其五是在2个胚囊(1.33%)内发现，两个精子核均进入次生极核内而在卵细胞内没有精子的进入。其六是在2个胚囊(2.67%)内卵器中存在着两个卵细胞，在它们的基部各有一个肌动蛋白冠引导精子核分别与两个卵细胞发生受精作用，这可能是ASDOR05－01多胚的来源之一。其七是在5个胚囊(3.33%)内反足细胞团没有正常地发生解体消失，而是逐渐发育成类似于合子胚状的“拟胚”形态。其八是3个胚囊(2.00%)内由胚乳细胞形成胚乳型胚状体，并且胚乳型胚状体的发育时间早于合子胚的发育时间。其九是在4个胚囊(2.67%)内没有观察到合子胚的发育，而在珠孔端胚囊外壁与珠心组织之间的空腔内存在着梨型胚，其发育时间比正常的合子胚的发育时间滞后。

对3份试验材料的受精频率和结实率的统计结果表明，在受精类型、结实率以及两者之间的相关性上因试验材料的种类而表现出明显的差异性。正常双受精频率与其结实率存在着一定的正相关关系，即正常双受精频率越高，其结实率越高。胚囊败育频率或异常受精频率与其结实率存在着一定的负相关关系，即胚囊败育频率或异常受精频率越高，其结实率越低。在3份试验材料中，二倍体水稻99－01₍₂₎正常双受精频率最高而胚囊败育频率或异常受精频率最低，其结实率最高。ASDOR05－01正常双受精频率最低而胚囊败育频率或异常受精频率最高，其结实率最低(表2)。由此可见，ASDOR05－01具有更弱的有性生殖能力，其遗传可塑性更强，这为离子束介导技术的研究找到了比较好的受体材料。(www.chuimin.cn)

表2　试验材料的受精频率及其结实率

2.3　ASDOR05－01产生双苗的胚胎学证据

根据对3份试验材料成熟胚囊的状态、双受精作用和胚胎发育过程的观察结果，同源四倍体水稻品系99-01₍₄₎和二倍体水稻品系99－01(2)不存在产生双苗的胚胎学证据，而ASDOR05－01产生双苗的胚胎学证据主要涉及4个方面。其一是双苗来源于由双套胚囊所形成的假多胚。在对ASDOR05－01成熟胚囊的观察过程中发现了一些双套胚囊，在双套胚囊内各有一套卵器，它们可以分别发生受精作用，进而发育成假双胚。其二是在卵器中的卵细胞和类卵细胞分别通过受精作用而形成双胚。在ASDOR05－01成熟胚囊内以及开花后的胚囊内都存在着一定频率的双卵卵器，双卵卵器中的卵细胞和类卵细胞可以分别发生受精作用而形成双胚。其三是由反足细胞通过异常发育后形成双胚。在对ASDOR05－01胚胎发育过程的观察中发现，在某些胚囊内的反足细胞在开花后3 d并不按照正常的发育程序发生解体消失，而是逐渐发育成拟胚状结构，这种拟胚有可能是ASDOR05－01形成双胚的来源之一。其四是由胚乳细胞通过异常发育后形成胚乳型胚状体。在对ASDOR05－01胚胎发育过程的观察中发现，胚乳细胞可以发育成胚乳型胚状体，在发育时间上胚乳型胚状体的发育进度比合子胚的发育进度要快一些。当胚乳型胚状体已经开始器官分化时合子胚还处于球形胚阶段。

3　讨论

水稻遗传改良的核心问题就是如何有效地创造遗传性变异和筛选出优良的基因型，即围绕生物体遗传变异现象，利用现代生物技术有效地使具有相对保守的基因型发生遗传性变异，通过基因分离和重组后产生出各种各样的基因型，在分离群体内准确地筛选出符合育种目标的更加优良的基因型。利用低能离子注入技术创造水稻新种质的实用性已经被大量的试验结果所证实^［8］。在离子束生物技术的未来发展历程中的一项重要任务就是对突变体后代材料所表现的性状特异性进行更加深入地研究。我们利用低能氮离子束对同源四倍体水稻进行辐照处理后在其后代群体内筛选到具有双胚苗特征的突变体，对其生殖发育特性值得进行深入研究。

我们利用激光共聚焦扫描技术对同源四倍体双胚苗水稻及其亲本材料在开花后不同时间段雌雄配子或雌雄配子体的发育特征和受精作用的特异性进行了观察鉴定。研究结果表明，同源四倍体水稻和二倍体水稻在发生受精作用的时间上没有存在着很大的差异。双胚苗水稻的受精作用和胚胎发育表现出明显的特异性，其双胚苗性状有其胚胎学根源，双胚可能有4种来源，即来源于由双套胚囊形成的双胚、由多卵卵器中的卵细胞和类卵细胞分别通过受精作用形成双胚、由特异性的反足细胞通过异常发育后形成额外的幼胚、由胚乳细胞通过异常发育后形成胚乳型幼胚。通过对试验材料的受精频率及其结实率进行比较后发现，双胚苗水稻具有更弱的有性生殖能力，其遗传可塑性更强，这很可能为离子束介导技术的研究找到了比较好的受体材料。

参考文献

［1］郭学兴．中国水稻无融合生殖研究进展［M］．成都:四川科学技术出版社，1991．

［2］黄群策．被子植物的无融合生殖［M］．福州:福建科学技术出版社，2000．

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［7］黄群策，孙敬三，白素兰．同源四倍体水稻雌雄配子体多态性的研究［J］．杂交水稻，1999，14(1):32－33．

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【注释】

(1)该文曾在《激光生物学报》 ［2007，16(3):253～258］刊出