低能离子束在生物工程中的发展趋势

低能离子束生物工程的发展趋势⁽¹⁾

黄群策　彭建军

摘要简述了低能离子束生物技术在6个主要方面的研究成果。随着离子束生物技术不断发展，迫切需要建立一个更加完善的物理学平台，急待形成一个更加完整的研究体系，有必要借助于其他学科的新技术或新工艺形成一个相互补充的技术集成体系，更应该将离子束生物技术的实用性和普遍性的范围不断地拓宽。明确提出了低能离子束生物工程的技术思路，即立足于低能离子束这一物理学技术平台，瞄准2个发展方向，促进3个有效转变，分清4个研究层次，注重五大生物学特性。

关键词低能离子束生物技术;研究体系;技术思路

人类近代生物体遗传改良的历史经验已经充分地证明，生物体新材料的发现、生物体遗传改良新方法的建立和研究生物体新思路的提出，都有可能使改良生物体的遗传操作水平得到明显提高，从而，能够有效地挖掘其潜在的实用价值。从生物体遗传改良的发展进程来看，研究方法的创新主要围绕着两个方面展开研究，即如何更有效地在生物体群体内创造出丰富多彩的遗传性变异个体和怎样更准确地筛选出具有实用价值的优良基因型。在创造遗传性变异群体的过程中，无论是物理学方法还是化学方法，都会涉及多种多样的诱变源或诱变剂。低能重离子是指能量在100 keV～10meV之间而其原子序数大于氦原子序数的剥离原子核。已经证实，重离子具有一定的静止质量，经过加速后将其注入生物体后可以引起能量沉积、质量沉积、动量传递和电荷交换。离子束生物技术是低能重离子生物学的一个重要组成部分，是利用离子的极化和离子群的团化产生生物学效应的高新技术。在20世纪80年代中期在我国被发现和挖掘的低能离子束生物技术，在创造生物体遗传性变异群体方面具有新颖性和实用价值。经过近20年的研究和探索，低能离子束生物工程作为一门新兴的交叉学科已经显现出其应有的技术特色，其技术的实用性和遗传改良的普遍性已被大量的试验结果所证实。然而，低能离子束生物工程在其进一步的发展中还面临着严峻的挑战，在其学科格局不断完善中仍然需要不断地探索新的技术思路和寻找到新的生长点。

1　低能离子束生物工程在探索中不断前进

任何一种原子或分子被电离后而失去一个或几个电子后就成为正离子，而任何一种原子或分子从外界俘获一个或几个电子后就成为负离子。20世纪80年代初，随着低能加速器配件技术的改进和离子注入技术的革新，国内外兴起了借助于离子束注入技术对物质材料的表面进行改性和重塑的研究热潮。中国科学院等离子体物理研究所的余增亮先生首先产生了“借助于低能离子注入技术使生物体的特征特性发生本质变化，进而对生物体进行遗传改良”的设想。科研人员在自家的院子里先后试种经过低能离子束处理后的小麦和大豆，其结果令人惊奇，即试验材料的株高表现为高矮不一致、其开花期有早迟之别、结实率依植株而有明显的差异。1986年春季在安徽省合肥市以水稻为试验材料所获得的研究结果表明，在苗期就观察到高频率的叶绿体畸变现象，这种变异现象类似于60Co－γ对水稻所引起的诱变效应，由此揭开了低能离子束生物工程的研究序幕。随后，余增亮先生提出了低能离子注入后会因为能量沉积、质量沉积、电荷交换而引起生物学效应的“三因子”假说，由此引起了国内外相关学者对这一具有我国独立知识产权、涉及物理学和生物学交叉领域的关注。

根据国内外相关学者对低能离子束生物技术的普遍性和实用性所提出的疑问以及新兴学科的发展迫切需要与国际接轨的建议，促进了低能离子束生物工程的快速发展和不断完善。在国家自然科学基金重点项目和重大项目、国家“八五”、“九五”、“十五”攻关等项目的资助下，低能离子束在生物学中的应用研究获得了快速发展。1991年，中国科学院等离子体物理研究所组建了国内外第一个离子束生物工程学专业研究室，吸引生物学人才，并大量招收物理、生物、化学背景的研究生。通过具有不同专业背景知识的研究人员展开相互讨论、结合不同学科思想的相互撞击和相互融合，促进了该新兴学科领域的创新研究^［1，2］。目前，低能离子束生物技术的研究范围涉及6个主要方面，即离子注入生物学效应的定量研究、注入离子与生物体相互作用的研究、离子注入后细胞生物学效应的研究、离子注入后在分子生物学水平上的效应研究、离子束介导外源遗传物质转移的研究和创造生物体新种质的实用技术研究。

在离子注入生物学效应的定量研究方面，通过微束或单离子束加速器的改进、细胞定位照射系统的完善、受体细胞图像重建技术的优化和精确定位系统的调整，使得低能离子束生物技术的研究已经从定性研究成功地向定量研究拓展。在注入离子与生物体相互作用的研究方面已经涉及3个方面的研究内容，即低能离子与生物体相互作用的物理过程、低能离子与生物体相互作用的物理化学模型的建立、低能离子注入与生物体内部分子发生反应的动力学源泉。当低能离子被注入生物体之时，不管是生物体内的分子、细胞、组织还是种子、幼胚、幼苗、生物体，都会表现出反常辐照损伤的奇异现象，即存活率随注入剂量增加呈现先降后升再降的趋势。在离子注入后细胞生物学效应的研究方面，以哺乳动物细胞的无性系为研究材料研究了其细胞的近旁效应。在低能离子注入后在分子生物学水平上的效应研究涉及利用现代分子生物学的检测方法(RFLP分析技术、RAPD分析技术、SSR分析技术、AFLP分析技术等)研究受体在微观上的差异性，由此寻找遗传物质发生变异的分子证据和探索其机制。在利用低能离子束介导外源遗传物质转移的研究方面，不但对其机制进行了一些探索性研究，而且也建立了比较完善的实用型技术体系。已经发现，低能离子束对生物体细胞的超微加工使得细胞的通透性会发生明显的改变;通过对照射剂量进行控制，可以在细胞和组织上形成可修复的微孔，这为外源遗传物质进入细胞提供了良好的通道。以大豆为DNA供体，已经获得了籽粒蛋白质含量高达18%以上的小麦新种质，而以银杏为DNA供体，已经获得了含有银杏内脂的西瓜新种质。在利用离子束生物技术创造生物体新种质的实用技术研究方面，创造了水稻、小麦、玉米、油菜、南瓜等新种质。已经证实，低能重离子被注入生物体后伴随着物理效应、化学效应和生物效应的产生，会引起生物体发生相应的变异，这为生物遗传育种家提供了大量的突变性材料。

大量的研究结果已经证实，离子束生物技术的基本原理就是荷能离子束本身所具有的质量、能量和电荷对生物体会产生直接的作用效应，其中包括质量沉积、能量沉积、电荷沉积、电子溅射、离子溅射、局部刻蚀和通道作用。除此之外，通过直接作用于生物体内所产生的自由基或特殊的化学物质再对生物体产生间接的作用效应，引起细胞内的遗传物质发生变异。离子束生物技术本身具有独特的技术原理和简单的操作程序，在作物育种中其实用性已经被越来越多的研究结果所证实，也引起了越来越多研究者的关注和重视。大量的研究结果表明，在荷能离子被注入生物体后所表现的生物学效应具有局部性、双重性和不易修复性。在具体的试验操作过程中荷能离子束的注入射程具有可控性、集束性和方向性，在损伤程度较轻的情况下可以获得比较高的突变率和比较宽的突变谱。

通过对离子束生物技术的机制进行研究后已经证实，荷能离子束对细胞的加工属于动量交换的冷加工作用，不会伤及未被照射的邻近组织或细胞，而电子束或激光对细胞的加工属于损伤性的热加工作用，对未被照射的邻近组织或细胞有比较大的损伤，所以，荷能离子束对细胞的加工效应明显地优于电子束或激光对细胞的加工效应。离子束对细胞的超微加工使得细胞的通透性发生明显的改变;通过对照射剂量进行控制，可以在细胞和组织上形成可修复的微孔，这为外源遗传物质进入细胞提供了良好的通道^［3，4］。

2　低能离子束生物工程在发展中面临着严峻的挑战

在20世纪后半叶，随着低能加速器装置的不断改进和重离子注入技术的不断革新，低能离子与物质相互作用的研究范围不断拓宽，其研究对象从无生命的物体(气体、固体、高分子材料)扩展到生物体(植物、动物、微生物)，由此为离子束生物工程的产生和发展提供了一个良好的物理学平台。经过近20年的不断探索，在低能离子束生物技术的发展过程中其生物学效应的实用性和普遍性已经被越来越多的实验结果所证实，一些简单的生物学问题已经被阐明，离子束生物技术的一些简单机制已经被证实，一些实用性技术体系已经建立并不断得到完善。然而，低能离子束生物工程在发展中仍然面临着严峻的挑战，还有一些更引人注目的问题值得研究，今后在该领域内的研究难度会越来越大。随着离子束生物技术不断发展，迫切需要建立一个更加完善的物理学平台，急待形成一个更加完整的研究体系，有必要借助于其他学科的新技术或新工艺形成一个相互补充的技术集成体系，更应该将离子束生物技术的实用性和普遍性的范围不断地拓宽。

低能离子束生物工程的进一步发展在很大程度上必须依赖于一个更加完善的物理学平台。低能离子束生物工程是以低能加速器和重离子注入技术为基础，研究低能离子与生物体相互作用及其生物学效应的交叉学科。该学科的进一步发展在很大程度上依赖于微束装置的建立和改进，即建立可控性更强的单粒子加速器，确定细胞图像重建和精确定位的技术体系。关于单粒子束加速器系统的技术研究，涉及微束的准确直射、微束的散射、粒子角的分布、单粒子探测(超薄晶体探测器检测技术)、细胞图像分析技术、无损伤细胞染色技术、活细胞结构显微分析技术和细胞微区激光定位技术等。随着低能离子束生物工程的研究进一步向微观领域深入，迫切需要建立细胞精密操纵系统(细胞无损伤固定技术、细胞无损伤折除技术和细胞三维精确操纵技术)和粒子数精确定位照射控制系统(快速电子开关技术和控制软件包技术)。随着与低能离子束注入技术有关的物理学平台的不断完善，将有助于促进低能离子束生物工程在对生物体进行遗传改良的过程中不断地由非定向研究朝着定向研究迈进。

低能离子束生物工程是利用低能离子束作为诱变源对生物体进行遗传改良的交叉学科，其中包括对生物体进行诱变后的遗传改良和通过介导外源遗传物质后对受体的遗传改良。从目前的研究现状来看，学科内的研究资料缺乏系统性和完整性，即研究项目所涉及的生物种类比较多但对每一种生物的研究深度还比较肤浅;对低能离子束诱变的当代效应研究得比较多而对其后效性并没有给予高度重视;对某些生物内特定材料研究得比较多而忽视了同一植物的不同基因型对低能离子束诱变作用会表现出不同的生物学效应;在通过介导外源遗传物质对受体进行遗传改良的过程中对后代的表现型效应研究得比较多而对其细胞学机制、生理生化基础和分子生物学机制的研究比较少;在实验材料的选择上杂合体材料比较多而纯合体材料比较少;在实验设计上单因子研究和一次性试验比较多而多因子研究和重复性试验比较少;在不同生物中发现了许多因低能离子束注入所引起的特殊的生物学现象而没有抓住这些现象后进一步揭示其产生的根源。

借助于其他学科的新技术或新工艺形成一个相互补充的技术集成体系将有利于离子束生物技术不断完善。科学技术上的大突破和研究方法的不断创新促使现代生物学的研究正向着微观和宏观这两个方向发展，从小到亚细胞、分子、量子，大到群体、生态系统、生物圈的范围内不断拓展。离子束生物技术的不断完善在很大程度上也需要借助于其他学科在技术上和研究方法上的研究成果。利用激光扫描共聚焦显微技术可以探测生物体在经过低能离子注入之后其细胞内微管微丝的分布特点、胚囊构型的特殊性、雌雄配子或雌雄配子体的发育特性、受精作用和幼胚发育的状况等等。利用遗传工作站的图像分析技术可以对受体的核型特点、染色体组的组型变化、染色质和染色体的动态变化、染色体的区段变异等进行深入研究。利用流式细胞仪及其分析技术可以研究生物体在经过低能离子注入之后其细胞的发育状态和凋亡状态，也可以对特定细胞团内的细胞进行鉴定和分选。利用质子激发X荧光(PIXE)技术和俄歇电子譜(AES)技术等物理学分析技术有助于对受体细胞内部的微观结构及其时间域进行精确检测，由此阐明低能离子束对细胞、亚细胞或细胞器的生物学效应。利用物理学的研究成果将低能离子束聚焦到微米(μm)以下的状态，再通过离子束对受体细胞、细胞核和特定细胞器进行照射，选择性地损伤一部分结构或切除特定的基因，这将有助于在离子束生物工程中形成细胞加工和定向遗传改良的新技术体系。

随着离子束生物技术的实用性和普遍性的范围不断地拓宽，低能离子束生物工程的学科发展将更加迅速，有望建立一个高效的实用技术体系。从近10多年来低能离子束生物工程的研究结果来看，其探索的范围主要局限在对生物体某一物种内特定品种或品系的研究，尚未跳出生物体常规遗传改良的技术范畴。从目前生物体常规遗传改良的发展趋势来看，试图在特定物种内对生物体进行遗传改良，进而期望着获得突破性成果的难度会越来越大，而打破物种间的生殖隔离和遗传隔离，促进异源遗传物质在不同物种间进行交流和重组的发展方向则向人类展现出广阔的研究前景^［5－8］。低能离子束对生物体的溅射作用会破坏细胞壁和细胞膜结构，为外源遗传物质进入细胞提供良好的微通道;伴随着离子注入的质量沉积会降低细胞表面的负电性，减弱了受体对外源遗传物质的静电排斥作用;低能离子束对生物体的直接作用和间接作用会打断细胞内染色体的部分结构，这有利于外源遗传物质整合到基因组中。因此，在近缘物种间和远缘物种间建立离子束生物工程的高效技术体系将是值得探索的新的研究方向。

低能离子束生物工程在不断完善中的技术思路。我国从事低能离子束生物技术工作的研究者当前特别需要考虑的问题是，在对生物体进行遗传的过程中，在确保生物体具有优质特性和绿色特性(抗逆性强和无污染)的前提下，采取何种有效措施和技术路线来确保新的生物品种具有更大的产量潜力。离子束生物工程近期的发展目标就是进一步完善学科的理论框架，形成一个更加完整的研究体系，借助于其他学科的研究成果和发展思路形成一个相互补充的技术集成体系，不断拓宽离子束生物技术的实用性范围。根据这一发展目标，本文提出低能离子束生物工程的技术思路，即立足于低能离子束这一物理学技术平台，瞄准2个发展方向，促进3个有效转变，分清4个研究层次，注重五大生物学特性。(www.chuimin.cn)

低能离子束生物工程是立足于以低能离子作为新的诱变源这一物理学技术平台，采用低能离子注入技术对生物体进行遗传改良的新兴的交叉学科领域。从目前的研究现状来看，围绕低能离子注入所涉及的一些物理学问题仍然需要进一步研究和探索。对学科内在离子注入后因能量沉积、质量沉积、电荷交换而引起生物学效应的“三因子”假说，还需要从生物物理学角度加以进一步论证。在靶室内低能离子束的均匀性和可控性、低能离子束束线直径的最小化、低能离子定点注入的装置系统和技术体系、离子定点注入装置的小型化、靶室内温度的可控性、从物理学角度提高被注入材料成活率的技术研究等问题都急待解决。围绕着诱变源的实用性和高效性以及对不同生物样品进行遗传改良的适应性展开探索和研究，将有助于为低能离子束生物工程的进一步拓展建立一个良好的物理学平台。

低能离子束生物工程必须瞄准2个发展方向，即低能离子束对生物体的诱变作用和异源遗传物质的介导作用。从学科的发展趋势来看，诱变效应的研究和应用主要瞄准对生物物种内不同遗传型的改良，其中包括对特定物种内不同亚种、不同生态型、不同品种和品系的遗传改良;介导作用的研究和应用主要瞄准对生物物种间遗传物质的交流展开技术探索，其中包括对受体亲本的改造、生物体新类型的创造、生物体新亚种或新物种的形成。尽管如此，低能离子束生物工程必须立足于对生物体进行有效地遗传改良，加速生物体的进化历程，充分挖掘其增产潜力和实用价值。

在低能离子束生物工程的研究范围内需要促进3个有效转变，即从对生物体的形态学研究转变为在注重形态学效应的同时探索性状表现的遗传学规律和遗传机制、从对当代效应的研究为主转变为在注重当代效应的基础上进一步研究突变性状的后效性、从对单一效应的研究为主转变为在研究单一效应的同时进一步研究突变性状的综合效应。完成3个有效转变是学科发展的需要，由此将提高学术研究水平。

在低能离子束生物工程的研究范围内需要分清4个研究层次，即在群体水平的研究、个体水平的研究、在细胞(亚细胞)水平的研究和在分子水平的研究。从过去的研究动态来看，经过低能离子注入或介导之后对个体的生物学效应做了一些研究，但研究并不深入，也缺乏系统性;对突变体的分子检测工作由于分子生物学的研究方法和技术程序尚不完善而没有获得令人满意的研究结果;对群体水平和细胞水平的变异动态和变异规律还需要进一步探索。从学科的发展趋势来看，这4个研究层次的工作均需要进一步深化，同时也需要将各层次的研究结果相互补充，以便寻找到客观规律。

在低能离子束生物工程的研究工作中需要注重对五大生物学特性的研究，即经过低能离子注入或介导之后对后代的生殖特性、发育特性、光合特性、抗逆特性和品质特性的研究。在生殖特性的研究中需要注意试验材料的减数分裂是否正常、雌雄配子或雌雄配子体的发生状态和发育状态、受精作用是否异常、幼胚和胚乳的发育状态、是否存在着雄性不育现象、雌性不育现象和无融合生殖现象。在发育特性的研究中需要注意幼苗和植株的株叶形态、生长势、光周期特性和春化特性。在光合特性的研究中需要注意光合强度、光合势和叶绿体的光合效率。在抗逆特性的研究中需要注意对非生物性抗逆性(抗旱性、抗寒性、耐盐性和耐碱性等)的筛选是主要的研究目标，而对生物性抗逆性(抗病性和抗虫性等)的筛选是次要的研究目标。在品质特性的研究中需要注意满足人们需求，不断提高生物产品的市场品位和市场价值。

参考文献

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【注释】

(1)该文曾在《激光生物学报》 ［2005，14(6):25～30］刊出