水稻染色体组多倍化研究，实现生物体遗传改良

离子束介导技术在生物体遗传改良上的发展趋势⁽¹⁾

黄群策

摘要　在利用离子束介导技术对生物体进行遗传改良的研究领域内仍然存在着七大研究难题值得注意。明确提出了离子束介导技术在进一步发展中的技术思路，即立足于离子束介导技术这一物理学技术平台，注重研究2个关键性问题，在研究中完成3个有效转变，寻找4个方面的试验证据，研究五大生物学特性。

关键词　离子束介导技术;七大研究难题;技术思路

1　引言

从生物体遗传改良的发展历程来看，研究者主要围绕着四大问题展开研究，即创造出遗传性变异、筛选出优良的新种质、尽快稳定优良的基因型和迅速扩大优良基因型的群体，其中，研究者在创造生物体遗传性变异群体方面的研究成果特别突出。现代生物体遗传改良在研究方法上的创新主要围绕着两个方面进行探索，即如何通过物种内或物种间遗传物质的交流或重组之后在生物体后代群体内更有效地创造出更加丰富多彩的遗传性变异个体和怎样更准确地在变异群体内筛选出具有实用价值的优良新种质。

在20世纪80年代初，随着低能加速器配件技术的改进和离子注入技术的革新，在全球范围内兴起了借助于低能离子束注入技术对物质材料的表面进行改性和重塑的研究热潮。这种特异性学科大环境导致了中国科学院等离子体物理研究所的余增亮先生首先产生了新的设想，即“借助于离子注入技术使生物体的特征特性发生本质变化，进而对其进行有效的遗传改良。 ”经过20多年的研究和探索，离子束生物工程作为一门新兴的交叉学科已经显现出其应有的技术特色，其技术的实用性和对生物体遗传改良效果的普遍性已经被大量的试验结果所证实。在利用离子束注入技术对生物体进行遗传改良的实际应用中涉及两个方面的研究主题，即对特定基因型的诱变效应和促进异源遗传物质转移的介导作用。随着离子束生物技术的实用性和普遍性的研究范围不断地拓宽，离子束生物工程的学科发展将更加迅速，有望建立一个高效的实用技术体系。从建立离子束介导技术体系的发展历程来看，研究者主要围绕着3个研究主题展开技术探索，即离子束介导外源遗传物质的技术研究、离子束介导特异性目的基因的遗传转化研究和离子束介导总DNA导入受体的遗传转化研究。关于离子束介导外源遗传物质的技术研究，研究者主要研究了通过离子注入后在受体组织内形成离子通道的可能性、不同注入离子的特殊效果和离子注入中所涉及的物理学技术参数这3个方面的问题。关于离子束介导特异性目的基因的遗传转化研究，前人分别以多种作物为受体从其介导试验中获得了一些有意义的试验结果。关于离子束介导总DNA导入受体的遗传转化研究，涉及的作物主要是水稻、小麦、棉花和西瓜，外源遗传物质的供体种类比较多，研究结果的实际影响比较大。通过这3个方面的探索和研究，离子束介导技术的实用性得到了充分肯定。然而，从目前的研究现状来看，离子束介导技术在实际应用中仍然存在着一些问题值得注意，迫切需要提出相应的研究对策和新的技术思路，以便促进其在生物体遗传改良中得到更好的应用。

2　在利用离子束介导技术对生物体进行遗传改良时研究者需要引起注意的一些问题

在离子束生物工程的起始阶段，余增亮先生大胆地提出了生物体被离子注入后会因为能量沉积、质量沉积和电荷交换而引起生物学效应的“三因子”假说，由此引起了国内外相关学者对这一具有我国独立知识产权、涉及物理学和生物学交叉领域的高度关注，由此揭开了离子束生物工程的研究序幕^［1，2］。大量的研究结果表明，在荷能离子被注入生物体后所表现的生物学效应具有局部性、双重性和不易修复性。在具体的试验操作过程中荷能离子束的注入射程具有可控性、集束性和方向性，在损伤程度比较轻的情况下可以获得比较高的突变率和比较宽的突变谱。通过对离子束生物技术的机制进行研究后已经证实，荷能离子束对细胞的加工属于动量交换的冷加工作用，不会伤及未被照射的邻近组织或细胞，而电子束或激光对细胞的加工属于损伤性的热加工作用，对未被照射的邻近组织或细胞有比较大的损伤，所以，荷能离子束对细胞的加工效应明显地优于电子束或激光对细胞的加工效应。离子束对细胞的超微加工使得细胞的通透性发生明显的改变;通过对照射剂量进行控制，可以在细胞和组织上形成可修复的微孔，这为外源遗传物质进入细胞提供了良好的通道^［3］。从离子束介导技术的发展趋势来看，在近缘物种间和远缘物种间建立离子束生物工程的高效介导技术体系将是值得探索的新的研究方向。

为了进一步完善离子束介导技术、拓宽其应用范围和挖掘其潜在的实用价值，迫切需要对该研究领域内目前所存在的局限性有比较清晰的认识。从目前的研究资料来看，在利用离子束介导技术完成异源遗传物质转移的研究领域内尚存在着七大问题值得注意。

在利用离子束介导技术促进异源遗传物质在不同物种间或同一物种内不同基因型之间进行交流和转移的研究中，遗传物质的供体与受体在分类学上的亲缘关系与其遗传转化效果的相关性是值得注意的第一个学术问题。生物体经过长期地进化之后，以物种为单位的基因库和物种之间的生殖隔离状况已经形成，由此确保了物种的相对稳定性和限制了物种间遗传物质的交流和转移。现代生物体遗传改良的主要任务就是如何更有效地促进物种内或物种间遗传物质的交流，进而创造出更加丰富多彩的遗传性变异个体。在利用离子束介导异源遗传物质进行遗传转化试验中，除了将银杏的遗传物质转入西瓜为受体的遗传转化试验^［6］涉及异源遗传物质在不同科植物之间进行交流之外，其他的遗传转化试验所涉及的供体与受体均没有超出分类学上科的界限^［7，8］。从我们近年来的研究结果来看，供体与受体在分类学上的亲缘关系与其遗传转化效果的相关性因试验材料的种类不同而异，在分类学的一定范围内呈现出正相关性而超出分类学的一定范围则呈现出负相关性。在今后的介导试验中供体和受体的选择和搭配值得引起高度注意。

在该研究范围内的试验资料比较零散，缺乏系统性和完整性是值得注意的第二个问题。在20多年的探索中，研究者所采用的生物种类比较多，但对每一种生物的研究深度还比较肤浅;对某些生物内特定材料研究得比较多而忽视了同一种生物体的不同基因型对离子束介导作用所表现出的不同的生物学效应;在通过介导外源遗传物质对受体进行遗传改良的过程中对后代的表现型效应研究得比较多而对其细胞学机制、生理生化基础和分子生物学机制的研究比较少;在实验材料的选择上采用杂合体材料比较多而纯合体材料比较少;在实验设计上单因子研究和一次性试验比较多而多因子研究和重复性试验比较少;在不同生物中发现了许多因离子束介导异源遗传物质所引起的特殊的生物学现象而没有在抓住这些特异性现象后进一步揭示其产生的根源。从研究中所存在的局限性来看，关键性的原因就是在介导试验中根本没有采用比较完整的试验设计或试验设计存在着一定的局限性。

对介导试验的后效性研究，其中包括对介导后代群体内突变性状表达的规律性没有进行系统性的跟踪研究，对离子束介导的当代效应研究得比较多而对其后效性并没有给予高度重视，这是值得注意的第三个问题。从目前公开报道的研究资料来看，无论是以水稻为受体或以小麦为受体的介导试验还是以西瓜为受体的介导试验，除了试验设计比较简单之外，研究者并没有对后代群体内单株性状的变异特征和突变体性状的分离动态进行深入研究，对其异源遗传物质在受体内发生遗传重组后所导致的后效性以及由此所表现的规律性仍然感到模糊不清。在某些试验中研究深度不够，研究者并没有抓住某些突变体的特征特性进行更加深入地遗传学分析和研究，以至于目前对一些具有特异性学术价值或潜在实用价值的突变体材料及其后代的遗传动态仍然没有清晰的认识，进而使研究的深度很有限。

在介导试验的突变体后代群体内寻找发生遗传转化的生物学证据时所存在的片面性是值得注意的第四个问题。从生物学的发展历程、生物学研究层次和遗传改良的研究体系来看，借助于现代生物技术完成了异源遗传物质从供体向受体转移之后，在受体的后代群体内变异的特征特性会不定向地涉及生物学的各个方面，其中包括外观的形态学变异、细胞学水平的变异、染色体区段的结构变异、生理生化特性的变异和在分子水平上特定基因的变异等等。在现有的研究中，有相当一部分研究者在介导后代群体内寻找介导试验成功的证据时，往往只迷信于寻找分子生物学证据而对于突变体在其他方面的特征特性往往没有引起足够的重视，以至于在介导试验中的一些很明显的试验证据通常被研究者所忽视，进而导致在介导后代群体内的一些很可能具有潜在研究价值和实用价值的新种质随着世代的推移而丢失。

在试验中研究的重复性很少引起研究者的关注，这是值得注意的第五个问题。在生物学研究中试验设计的重复性有助于消除试验误差，而试验次数的重复性有助于寻找出生物学的客观规律。从目前公开发表的有关离子束介导试验的研究论文来看，单一性试验设计比较多而重复性试验设计很少;对于已经获得良好介导试验效果的试验，研究者通常都没有按照原有的试验设计再次进行重复性试验。正因为如此，研究者对介导试验中所存在的试验误差往往估计不足，很难寻找出特定介导试验中所存在的突变体性状的遗传动态及其生物学客观规律。

关于离子束介导试验的机制和机制，研究者仍然感到模糊不清，这是值得注意的第六个问题。继离子束生物技术的“三因子”假说(即由离子束的能量沉积、质量沉积和电荷交换而引起生物学效应的假设)提出之后，研究者进一步证实“离子束对细胞的超微加工使得细胞的通透性发生明显的改变;通过对照射剂量进行控制，可以在生物体的细胞和组织上形成可以修复的微孔，这为外源遗传物质进入细胞提供了良好的通道^［4，5］”。值得肯定的是，借助于离子束介导后某些异源遗传物质可以进入受体并在其后代可以表达，即离子束介导技术的实用性已经得到大量试验结果的证实。然而，关于异源遗传物质如何进入受体的问题仍然值得进一步研究，而异源遗传物质在受体遗传组成中如何发生基因重组的方式和机制问题更是有待于深入探索。

关于离子束介导技术的超前性研究问题，很少有研究者进行深入探讨，这是值得注意的第七个问题。随着人类社会在不断地发展，人们的社会需求也会发生相应的变化。生物体遗传改良的效果在很大程度上决定于是否能满足社会的需求和人们的需要。离子束作为一种具有一定特异性的诱变源对于促进异源遗传物质的交流，特别是促进异源物种间遗传物质的交流具有重要的生物学意义。从现有的文献报道结果来看，在离子束介导异源遗传物质的研究领域内跟踪性研究比较多而具有战略性意义的超前性研究太少，由此很可能会导致其在进一步发展的历程中出现明显的局限性。

3　从学科的发展趋势探讨不断完善离子束介导技术的近期目标

随着离子束介导技术在生物体遗传改良中的实用性和遗传转化的普遍性被大量的试验结果所肯定，其研究难度不断加大。从学科的发展趋势来看，离子束介导技术的近期发展目标就是迫切需要在进一步完善离子束生物工程学科的理论框架和对目前所存在的主要问题有比较清晰认识的前提下，形成一个更加完整的技术体系，即利用离子束介导技术有效地促进异源遗传物质在不同物种间或同一物种内不同基因型之间进行交流和转移，进而对受体材料进行有效地遗传改良的研究体系。与此同时，也迫切需要借助于其他学科的研究成果和发展思路形成一个相互补充的技术集成体系，以便不断拓宽离子束介导技术的实用性研究范围。基于这一认识，本人提出不断完善离子束介导技术的近期发展目标，即立足于离子束介导技术这一物理学技术平台，重点研究介导机制上的2个关键性问题，在对介导后代群体进行研究和筛选时注重3个有效转变，在寻找遗传转化的试验证据时从4个方面展开，在对受体后代进行鉴定时以五大生物学特性作为遗传改良的育种目标。

离子束介导技术必须立足于以离子束作为新的诱变源这一物理学技术平台，采用离子注入技术使受体组织形成离子通道，由此促进异源遗传物质进入受体的遗传组成中，进而对生物体进行有效地遗传改良。从学科的发展趋势来看，围绕着离子束注入所涉及的一些物理学基本问题仍然需要进一步研究和探索。对于学科内在离子注入后因能量沉积、质量沉积、电荷交换而引起生物学效应的“三因子”假说，还需要从生物物理学角度加以进一步论证。在靶室内离子束的均匀性和可控性、离子束束线直径的最小化、离子定点注入的装置系统和技术体系、离子定点注入装置的小型化、靶室内温度的可控性、从物理学角度提高被注入材料成活率的技术研究等问题都急待解决。围绕着离子束诱变源的实用性和高效性以及对不同生物样品进行遗传改良的适应性展开探索和研究，将有助于为离子束介导技术的进一步拓展建立一个良好的物理学平台，由此更有利于进一步完善离子束生物工程的技术体系。(www.chuimin.cn)

在进一步完善离子束介导技术的过程中必须注重研究2个关键性问题，即通过离子束介导之后异源遗传物质如何进入受体基因组的机制和在受体遗传组成中如何发生异源基因重组的机制。前人的研究结果已经证实，离子束介导技术具有独特的技术原理和简单的操作程序，在作物遗传改良中的实用性已经被越来越多的研究结果所证实，也引起了越来越多研究者的关注和重视。离子束对细胞的超微加工使得细胞的通透性发生明显的改变;通过对照射剂量进行控制，可以在细胞和组织上形成可以修复的微孔，这为外源遗传物质进入细胞提供了良好的通道。然而，对于异源遗传物质如何进入受体的遗传组成的机制和在受体遗传组成中如何发生基因重组的机制目前仍然值得进行更进一步的探索和研究，这将有助于从根本上确定离子束介导技术在生物体遗传改良中的科学性。

在离子束介导技术的实际应用中迫切需要完成3个有效转变，即从对受体后代群体或个体的形态学鉴定和筛选，有效地转变为在注重形态学变异特征的同时关注其变异性状的遗传学规律和遗传机制、从对介导当代群体内所表现的变异效应的研究为主，有效地转变为在注重当代群体内所表现的效应的基础上按照系谱法的筛选方法进一步研究突变性状在多个世代内所表现的后效性、从对突变体所表现的单一性状的效应的研究为主，有效地转变为在研究其单一性状效应的同时按照生物统计学原理进一步研究突变性状的综合效应。可以肯定的是，在离子束介导技术的实际应用中完成3个有效转变是学科发展的需要，由此将提高其学术研究水平，克服其研究的局限性。

在离子束介导技术的进一步发展中力求从4个研究层次寻找异源遗传物质在受体基因组内发生基因重组和适时表达的试验证据，即在形态学水平的特异性、在生理生化水平的特异性、在细胞(亚细胞)水平的特异性和在分子水平的特异性。遗传学的研究结果已经证实，生物体表现型的出现是在特定时间和特定空间由特定基因或基因群与相应的环境条件相互作用的结果，从基因型到表现型还涉及一系列复杂的生化代谢反应和生理代谢反应。在离子束介导技术的机制研究中，除了在分子水平进一步寻找异源遗传物质在受体基因组内发生基因重组和适时表达的试验证据或特异性之外，还迫切需要从其他研究层次进一步寻找其特异性。从离子束生物工程学科的发展趋势来看，对于4个研究层次的探索性研究工作均需要进一步深化，同时，也迫切需要将各个层次的研究结果相互补充和互相验证，以便从中寻找到更加客观的生物学规律。

在离子束介导技术的实际应用中迫切需要在介导后代群体内筛选具有五大生物学特征特性的特异性变异单株，并注重对其进行深入研究，即经过离子束介导之后对突变体后代的生殖特性、发育特性、光合特性、抗逆特性和品质特性进行深入的研究，由此提高其研究价值。在对突变体后代的生殖特性进行研究时需要注意试验材料的生殖特点，其中包括减数分裂是否正常、雌雄配子或雌雄配子体的发生状态和发育状态、受精作用是否异常、幼胚和胚乳的发育状态、是否存在着特异的生殖现象(雄性不育现象、雌性不育现象和无融合生殖现象等)。以突变体后代的生殖特性为筛选目标，将有可能从中发现具有特异性生殖方式的突变体，进而为生物体杂种优势的利用和固定杂种优势效应提供有用的新种质。在对突变体后代的发育特性进行研究时需要注意幼苗和植株的株叶形态、生长势、光周期特性和春化特性等。以突变体后代的发育特性为筛选目标，将有可能从中发现具有特异性发育方式的新种质，这将有助于培育具有优良株叶形态、旺盛的生长势和适应特定生态条件的新品种。在对突变体后代的光合特性进行研究时需要注意其光合强度、光合势和叶绿体的光合效率，由此将筛选出具有高光效特性的新种质，这将有助于进一步挖掘植物体的产量潜力。在对突变体后代的抗逆特性进行研究时需要注意对非生物性抗逆性(抗旱性、抗寒性、耐盐性和耐碱性等)的筛选是主要的研究目标，而对生物性抗逆性(抗病性和抗虫性等)的筛选是次要的研究目标。以突变体后代的抗逆特性为筛选目标，将有可能从中发现具有特异的抗性新种质，由此将培育出具有抗旱性、抗寒性、耐盐性和耐碱性等特性的新品种。在对突变体后代的品质特性进行研究时需要注意社会的发展趋势，尽量满足人们的需求，不断提高生物新产品的市场品位和市场价值。以突变体后代的品质特性为筛选目标，将有可能从中发现具有优良品质的新种质，由此培育出的新品种将具有良好的产品品质、食味品质、营养品质、外观品质和加工品质等，进而提高其经济价值，这将有助于解决生物品种在生产中高产与优质的矛盾。

4　离子束介导技术在生物体遗传改良中的研究展望

随着离子束生物技术的实用性和普遍性的研究范围不断地拓宽，离子束生物工程的学科发展将更加迅速，有望建立一个高效的实用技术体系。从近10多年来离子束生物工程的研究结果来看，其探索的范围主要局限在对生物体某一物种内特定品种或品系的研究，尚未跳出生物体常规遗传改良的技术范畴。从目前生物体常规遗传改良的发展趋势来看，试图在特定物种内对生物体进行遗传改良，进而期望着获得突破性成果的难度会越来越大，而打破物种间的生殖隔离和遗传隔离，促进异源遗传物质在不同物种间进行交流和重组的发展方向则向人类展现出广阔的研究前景^［9，10］。因此，在近缘物种间和远缘物种间建立离子束生物工程的高效介导技术体系将是值得探索的新的研究方向。

参考文献

［1］余增亮．离子束与生命科学——一个新的研究领域［J］．物理，1997，26(6):333－338．

［2］余增亮．离子束生物技术引论［M］．合肥:安徽科学技术出版社，1998，223－263

［3］陆挺，朱凤绥．离子注入植物种子的生物效应研究［J］．核技术，1994，17(7):443－448．

［4］宋道军，姚建铭，邵春林．离子注入微生物产生“马鞍型”存活曲线的可能作用机制［J］．核技术，1999，22(3):129－132．

［5］吴丽芳，李红，冯慧云，等．科学通报，2001，46(4):46－48．

［6］宋道军，陈若雷，尹若春，等．离子束介导植物分子超边缘杂交研究［J］．自然科学进展，2001，11(3):327－330

［7］WANGhaobo，GAO Xiubin.Plasma Science ＆ Technology，2002，4(6):1591－1596

［8］黄群策，梁秋霞，李玉峰，等．低能氮离子注入同源四倍体水稻的生物学效应［J］．激光生物学报，2003，12(5)355－359．

［9］黄群策，秦广雍．离子束生物技术改良同源四倍体水稻的设想［J］．郑州大学学报，2003，35(4):31－36

［10］黄群策，彭建军．低能离子束生物工程的发展趋势［J］．激光生物学报，2005，14(6):25－30

【注释】

(1)该文曾在《原子核物理评论》 ［2007，24(1):59～63］刊出