利用微生物技术治理水环境的实验方法

2023-11-24 理论教育版权反馈

【摘要】：适用于细菌与荧光抗体结合后的检测或鉴定。液体培养基接种法常用液体培养基包括肉汤、LB、7H9培养基，用无菌接种环或移液枪将少量菌液加入至液体培养基中，注意接种时不要与液体过多接触，防止形成气溶胶，污染实验室。想一想利用微生物净化水体的优缺点？

（一）显微镜观察

借助显微镜可以观察肉眼看不到的细菌、真菌等微生物。普通观察可利用光学显微镜，而电子显微镜则可观察内部亚显微结构。

常用显微镜有如下几种：

1.普通光学显微镜

普通光学显微镜由一套透镜组成，分为机械装置和光学系统两大部分，其中机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗准焦螺旋、细准焦螺旋。光学系统则包括反光镜、聚光器、物镜、目镜。光学显微镜波长约为0.4μm，分辨率为0.2μm，可用于细菌、真菌和放线菌的观察。

2.暗视野显微镜

暗视野显微镜的聚光镜中央有挡光片，光线不直接进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。其分辨率比普通显微镜高约50倍。

3.荧光显微镜

荧光显微镜大多采用落射光装置，在高压汞灯光源的作用下，发出蓝紫光或紫外光。适用于细菌与荧光抗体结合后的检测或鉴定。

4.电子显微镜

电子显微镜的光源为电子流，磁性电圈为光学放大系统，分辨率较高，可用于细菌、病毒等超微结构的观察。

（二）制片和染色

1.非染色标本

非染色标本主要针对需要观察生物的形态及运动情况的实验，未染色的细菌标本大多呈现无色透明状，带有鞭毛的细菌运动极快，无鞭毛的则呈现不规则运动。通常情况下，不同的细菌呈现不同的运动方式。

2.染色标本检查

标本染色后可以更清晰地辨识细菌的大小、形状等特征，对于具有特殊结构的生物根据染色可以进一步分类鉴定。

（1）细菌染色的一般程序

细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色—媒染—脱色—复染。

（2）涂片制备

血液、分泌物等液体培养物可在载玻片上直接做成薄膜涂片；菌落或菌苔等固体培养菌需用无菌接种环取少量的培养物置于盛有少量生理盐水的载玻片中央，涂布成涂面后自然干燥或烘干。

（3）固定

通常用火焰加热已干燥的涂片，可将涂片迅速在火焰中通过三次，从而杀死细菌，使其黏附在载玻片上，防止被水冲洗掉。

（4）染色

根据不同的实验原理和目的，滴加不同的染液进行染色。

（5）媒染

常用的媒染剂有明矾、金属盐、鞣酸和碘等，主要起到增强染料和被染物之间的亲和力。在初染与复染之间，固定之后均可利用媒染剂帮助染料固定。

（6）脱色

常用脱色剂有乙醇、丙酮等，主要目的是使已着色的被染物脱去颜色，最终起到鉴别染色的作用。(www.chuimin.cn)

（7）复染

利用复染液对脱色处理过的细菌进行复染，从而形成颜色差异，便于观察。

（三）微生物接种和培养

大多数细菌可直接利用培养基进行人工培养，但某些病毒的分离培养却往往需要特殊细胞株或动物接种，才能最终实现进一步的研究和应用。

1.接种与分离方法

根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。

（1）平板划线分离培养法

平板划线分离法可将原本多种细菌混杂的标本进行各自分离和培养，挑取单个菌落，获得纯种。平板划线分离法通常分为连续划线和分区划线分离法。连续划线需要在琼脂板上1/5 处轻轻涂抹，然后再用无菌接种环在平板表面连续曲线划线接种，直至划满琼脂平板表面。分区划线分离则先将琼脂平板分为4个区，用无菌接种环蘸取样本在1区涂布划线，接着在剩余区域依次划线，最后分别观察各区形成的菌落。

（2）琼脂斜面接种法

当菌落需要进行纯种鉴定或保存时，可用无菌接种针挑取单个菌落，从培养基斜面中央垂直刺入底部，沿直线向上抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。

（3）液体培养基接种法

常用液体培养基包括肉汤、LB、7H9培养基，用无菌接种环或移液枪将少量菌液加入至液体培养基中，注意接种时不要与液体过多接触，防止形成气溶胶，污染实验室。

（4）涂布接种法

常被用于药敏实验的细菌接种，取适量菌液加入固体琼脂培养基表面，接着用无菌涂布棒从不同角度进行反复涂布，使被接种液均匀分布在琼脂表面，最后贴上药敏纸片，或也可直接培养，观察最终菌苔形成情况。

2.细菌的培养方法

根据培养目的不同可对各种细菌进行分别培养。常用的细菌培养方法有需氧培养、微需氧培养、二氧化碳培养和厌氧培养四种。

（1）需氧培养

需氧培养是指需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下的培养。将接种完并晾干的平板倒置放于36℃培养箱内培养18～24h，观察细菌生长情况。注意需用遮光处理的可用锡箔纸包裹后放置培养。

（2）微需氧培养

部分微需氧菌的培养需要将其接种到相应培养基上后，置于含有5%～6%氧气、5%～10%二氧化碳和85%氮气的气体环境，35℃进行培养即可。