生物样品预处理方法及注意事项

2023-11-23 理论教育版权反馈

【摘要】：硝酸-高氯酸消解生物样品是破坏有机物比较有效的方法，但要严格按照操作程序，防止发生爆炸。测定生物样品中的氮沿用凯氏消解法，即在样品中加浓硫酸消解，使有机氮转化为铵盐。该方法将生物样品放入外包不锈钢外壳的聚四氟乙烯坩埚内，加入混合酸或氢氟酸，密闭加热，于140～160℃保温2～6h，即可将有机物分解，获得清亮的样品溶液。

由于生物样品中含有大量有机物（母质），且所含有害物质一般都在痕量或超痕量级范围，因此测定前必须对样品进行预处理，对欲测组分进行富集和分离，或对干扰组分进行掩蔽等，常用方法与一般样品预处理的方法相似。包括样品的分解和各种分离富集方法。

（一）消解和灰化

测定生物样品中的金属和非金属元素时，通常都要将其大量的有机物基体分解，使欲测组分转变成简单的无机化合物或单质，然后进行测定。分解有机物的方法有湿式消解法和干灰化法。这两种方法的基本内容在第二章已介绍，此处仅结合生物样品的分解略述之。

1.湿式消解法

生物样品中含大量有机物，测定无机物或无机元素时，需用硝酸-高氯酸或硝酸-硫酸等试剂体系消解。对于脂肪和纤维素含量高的样品，如肉、面粉、稻米、秸秆等，加热消解时易产生大量泡沫，容易造成被测组分损失，可采用先加浓硝酸，在常温下放置24h后再消解的方法，也可以用加入适宜防起泡剂的方法减少泡沫的产生，如用硝酸-硫酸消解生物样品时加入辛醇，用盐酸-高锰酸钾消解生物体液时加入硅油等。

硝酸-高氯酸消解生物样品是破坏有机物比较有效的方法，但要严格按照操作程序，防止发生爆炸。

硝酸-硫酸消解法能分解各种有机物，但对吡啶及其衍生物（如烟碱）、毒杀芬等分解不完全。样品中的卤素在消解过程中可完全损失，汞、砷、硒等有一定程度的损失。

硝酸-过氧化氢消解法应用也比较普遍，有人用该方法消解生物样品测定氮、磷、钾、硼、砷、氟等元素。

高锰酸钾是一种强氧化剂，在中性、碱性和酸性条件下都可以分解有机物。测定生物样品中的汞时，用（1＋1）浓硫酸和浓硝酸混合液加高锰酸钾，于60℃保温分解鱼、肉样品；用含50g/L高锰酸钾的浓硝酸溶液于85℃回流消解食品和尿液；用浓硫酸加过量高锰酸钾分解尿液等，都可获得满意的效果。

测定动物组织、饲料中的汞，使用加五氧化二钒的浓硝酸和浓硫酸混合液催化氧化，温度可达190℃，能破坏甲基汞，使汞全部转化为无机汞。

测定生物样品中的氮沿用凯氏消解法，即在样品中加浓硫酸消解，使有机氮转化为铵盐。为提高消解温度，加快消解过程，可在消解液中加入硫酸铜、硒粉或硫酸汞等催化剂。加硫酸钾对提高消解温度也可起到较好的效果。以—NH2及＝NH形态存在的有机氮化合物，用浓硫酸、浓硝酸加催化剂消解的效果是好的，但杂环、氮氮键及硝酸盐氮和亚硝酸盐氮不能定量转化为铵盐，可加入还原剂如葡萄糖、苯甲酸、水杨酸、硫代硫酸钠等，使消解过程中发生一系列复杂氧化还原反应，则能将硝酸盐氮还原为氨。

用过硫酸盐（强氧化剂）和银盐（催化剂）分解尿液等样品中的有机物可获得较好的效果。

采用增压溶样法分解有机物样品和难分解的无机物样品具有溶剂用量少、溶样效率高、可减少沾污等优点。该方法将生物样品放入外包不锈钢外壳的聚四氟乙烯坩埚内，加入混合酸或氢氟酸，密闭加热，于140～160℃保温2～6h，即可将有机物分解，获得清亮的样品溶液。

2.干灰化法

干灰化法分解生物样品不使用或少使用化学试剂，并可处理较大量的样品，故有利于提高测定微量元素的准确度。但是，因为灰化温度一般为450～550℃，不宜处理测定易挥发组分的样品。此外，灰化所用时间也较长。

根据样品种类和待测组分的性质不同，选用不同材料的坩埚和灰化温度。常用的有石英、铂、银、镍、铁、瓷、聚四氟乙烯等材质的坩埚。为促进分解或抑制某些元素挥发损失，常加入适量辅助灰化剂，如加入硝酸和硝酸盐，可加速样品氧化，疏松灰分，利于空气流通；加入硫酸和硫酸盐，可减少氯化物的挥发损失；加入碱金属或碱土金属的氧化物、氢氧化物或碳酸盐、乙酸盐，可防止氟、氯、砷等的挥发损失；加入镁盐，可防止某些待测组分和坩埚材料发生化学反应，抑制磷酸盐形成玻璃状熔融物包裹未灰化的样品颗粒等。但是，用碳酸盐作辅助灰化剂时，会造成汞和铊的全部损失，硒、砷和碘有相当程度的损失，氟化物、氯化物、溴化物有少量损失。

样品灰化完全后，经稀硝酸或盐酸溶解供分析测定。如酸溶液不能将其完全溶解，则需要将残渣加稀盐酸煮沸，过滤，然后再将残渣用碱熔法灰化。也可以将残渣用氢氟酸处理，蒸干后用稀硝酸或盐酸溶解供测定。

测定生物样品中的砷、汞、硒、氟、硫等挥发性元素，采用低温灰化技术，如高频感应激发氧灰化法和氧瓶燃烧法。

（二）提取、分离和浓缩

测定生物样品中的农药、石油烃、酚等有机污染物时，需要用溶剂将欲测组分从样品中提取出来，提取效率的高低直接影响测定结果的准确度。如果存在杂质干扰和待测组分浓度低于分析方法的最低检出浓度问题，还要进行分离和浓缩。

随着近代分析技术的发展，对环境样品中的污染物已从单独分析到多种污染物连续分析。因此，在进行污染物的提取、分离和浓缩时，应考虑到多种污染物连续分析的需要。

1.提取方法(www.chuimin.cn)

提取生物样品中有机污染物的方法应根据样品的特点，待测组分的性质、存在形态和数量，以及分析方法等因素选择。常用的提取方法有：振荡浸取法、组织捣碎提取法和脂肪提取器提取法。

（1）振荡浸取法：蔬菜、水果、粮食等样品都可使用这种方法。将切碎的生物样品置于容器中，加入适当的溶剂，放在振荡器上振荡浸取一定时间，滤出溶剂后，用新溶剂洗涤样品滤渣或再浸取一次，合并浸取液，供分析或进行分离、富集用。

（2）组织捣碎提取法：取定量切碎的生物样品，放入组织捣碎机的捣碎杯中，加入适当的提取剂，快速捣碎3～5min，过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液备用。该方法提取效果较好，应用较多，特别是从动、植物组织中提取有机污染物比较方便。

（3）脂肪提取器提取法：索格斯列特（Soxhlet）式脂肪提取器，简称索氏提取器或脂肪提取器（见图6-6），常用于提取生物、土壤样品中的农药、石油类、苯并[a]芘等有机污染物。其提取方法是：将制备好的生物样品放入滤纸筒中或用滤纸包紧，置于提取筒内；在蒸馏烧瓶中加入适当的溶剂，连接好回流装置，并在水浴上加热，则溶剂蒸气经侧管进入冷凝器，凝集的溶剂滴入提取筒，对样品进行浸泡提取。当提取筒内溶剂液面超过虹吸管的顶部时，就自动流回蒸馏烧瓶内，如此反复进行。因为样品总是与纯溶剂接触，所以提取效率高，且溶剂用量小，提取液中被提取物的浓度大，有利于下一步分析测定。但该方法费时，常用作研究其他提取方法的对比方法。

图6-6 索氏提取器

1.蒸馏烧瓶；2.滤纸筒；3.提取筒；4.虹吸管；5.冷凝器

（4）直接球磨提取法：该方法用正己烷作提取剂，直接将样品在球磨机中粉碎和提取，可用于提取小麦、大麦、燕麦等粮食中的有机氯和有机磷农药。由于不用极性溶剂提取，可以避免后续费时的洗涤和液-液萃取操作，是一种快速提取方法，加标回收率和重现性都比较好。提取用的仪器是一个50mL的不锈钢管，钢管内放两个小钢球，放入1～5g样品，加2～8g无水硫酸钠，20mL正己烷，将钢管盖紧，放在350r/min的摇转机上，粉碎提取30min即可。

提取剂应根据欲测有机污染物的性质和存在形式，利用“相似相溶”原理来选择，其沸点在45～80℃为宜。因为生物样品中有机污染物含量一般都很低，故要求提取剂的纯度高。此外，还应考虑提取剂的毒性、价格、是否有利于下一步分离或测定等因素。常用的提取剂有：正己烷、石油醚、乙腈、丙酮、苯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺等。为提高提取效果，常选用混合提取剂。

2.分离方法

用有机溶剂提取欲测组分的同时，往往也将能溶于提取剂的其他组分提取出来。例如：用石油醚等提取有机氯农药时，也将脂肪、蜡质、色素等提取出来，对测定产生干扰，因此，必须将其分离出去。常用的分离方法有：液-液萃取法、蒸馏法、层析法、磺化法、皂化法、气提法、顶空法、低温冷凝法等。

（1）液-液萃取法：液-液萃取法是依据有机物组分在不同溶剂中分配系数的差异来实现分离的（见第二章）。例如：农药与脂肪、蜡质、色素等一起被提取后，加入一种极性溶剂（如乙腈）振摇，由于农药的极性比脂肪、蜡质、色素大，故可被萃取分离。

（2）蒸馏法：该方法在第二章已介绍，其中，扫集共蒸馏法集蒸馏层析方法于一体，具有高效、省时和省溶剂等优点，适用于测定蔬菜、水果等生物样品中有机氯（磷）农药残留量。

（3）层析法：层析法分为柱层析法、薄层层析法、纸层析法等。其中，柱层析法在处理生物样品中应用较多，其原理是将生物样品的提取液通过装有吸附剂的层析柱，则提取物被吸附在吸附剂上，但由于不同物质与吸附剂之间的吸附力大小不同，当用适当的溶剂淋洗时，则按一定的顺序被淋洗出来，吸附力小的组分先流出，吸附力大的组分后流出，使它们彼此得以分离。常用的吸附剂有硅酸镁、活性炭、氧化铝、硅藻土、纤维素、高分子微球、网状树脂等。活化的硅酸镁层析柱常用于分离农药。表6-13列出以乙醚-石油醚混合溶剂为淋洗液分离各种农药的情况，淋洗液极性依次增大，淋洗下来的农药极性也依次增大。

表6-13 以乙醚-石油醚混合溶剂为淋洗液分离各种农药的情况

（4）磺化法和皂化法：磺化法的原理是利用提取液中的脂肪、蜡质等干扰物质能与浓硫酸发生磺化反应的性质，生成极性很强的磺酸基化合物，并进入硫酸层。分离硫酸层后，洗去残留在提取液中的硫酸，再经脱水，得到纯化的提取液。该方法常用于有机氯农药的净化，对于易被酸分解或与之发生反应的有机磷、氨基甲酸酯类农药则不适用。

皂化法是利用油脂等能与强碱发生皂化反应，生成脂肪酸盐而将其分离的方法。例如：用石油醚提取粮食中的石油烃，同时也将油脂提取出来，如在提取液中加入氢氧化钾-乙醇溶液，油脂与之反应生成脂肪酸钾进入水相，而石油烃仍留在石油醚中。

（5）气提法和顶空法：这两种方法也常用于分离生物样品提取液中的欲测组分或干扰组分，其原理见第二章。

（6）低温冷凝法：该方法基于不同物质在同一溶剂中的溶解度随温度不同而不同的原理进行分离。例如：将用丙酮提取生物样品中农药的提取液置于﹣70℃的冰-丙酮冷阱中，则由于脂肪和蜡质的溶解度大大降低而沉淀析出，农药仍留在丙酮中。经过滤除去沉淀，获得经净化的提取液。这种方法的最大优点是有机化合物在净化过程中不发生变化，并且有良好的分离效果。

3.浓缩方法

生物样品的提取液经过分离净化后，欲测污染物浓度可能仍达不到分析方法的要求，这就需要进行浓缩。常用的浓缩方法有：蒸馏或减压蒸馏法、K-D浓缩器法、蒸发法等。其中，K-D浓缩器法是浓缩有机污染物的常用方法。早期的K-D浓缩器在常压下工作，后来加上了毛细管，可进行减压浓度，提高了浓缩速率。生物样品中的农药、苯并[a]芘等极毒、致癌性有机污染物含量都很低，其提取液经净化分离后，都可以用这种方法浓缩。为防止待测物损失或分解，加热K-D浓缩器的水浴温度一般控制在50℃以下，最高不超过80℃。特别要注意不能把提取液蒸干。若需进一步浓缩，需用微温蒸发，如用改进的微型Snyder柱再浓缩，可将提取液浓缩至0.1～0.2mL。

生物样品预处理方法及注意事项

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