水环境污染生物监测方法

（一）污水生物系统法

污水生物系统是德国学者于20世纪初提出的，其原理基于：将受有机物污染的河流按照污染程度和自净过程，自上游向下游划分为四个相互连续的河段，即多污带段、α-中污带段、β-中污带段和寡污带段，它们都有各自的物理、化学和生物学特征。后来经过一些学者的研究和补充，津田等于1964年编制出表6-2所示的污水生物系统生物学和化学特征。根据所监测水体中生物种类的存在与否，划分污水生物系统，确定水体的污染程度。

表6-2 污水生物系统生物学和化学特征

续表

（二）生物群落监测方法

未受污染的环境水体中生活着多种多样的水生生物，这是长期自然发展的结果，也是生态系统保持相对平衡的标志。当水体受到污染后，水生生物的群落结构和生物个体数量就会发生变化，使自然生态平衡系统被破坏，最终结果是敏感生物消亡，抗性生物旺盛生长，群落结构单一，这是生物群落监测法的理论依据。此法是建立在指示生物的基础上的。

1.水污染指示生物法

水污染指示生物是指能对水体中污染物产生各种定性、定量反应的生物，如浮游生物、着生生物、底栖动物、鱼类和微生物等，它们对水环境的变化特别是化学污染反应敏感或有较高的耐受性。水污染指示生物法就是通过观察水体中的指示生物的种类和数量变化来判断水体污染程度的。

浮游生物是指悬浮在水体中的生物，可分为浮游动物和浮游植物两大类，它们多数个体小，游泳能力弱或完全没有游泳能力，过着“随波逐流”的生活。在淡水中，浮游动物主要由原生动物、轮虫、枝角类和桡足类组成。浮游植物主要是藻类，它们以单细胞、群体或丝状体的形式出现。浮游生物是水生食物链的基础，在水生生态系统中占有重要地位，其中多种对环境变化反应很敏感，可作为水污染的指示生物，所以，在水污染调查中，常被列为主要研究对象之一。

着生生物（即周丛生物）是指附着在长期浸没于水中的各种基质（植物、动物、石块、人工物品）表面上的有机体群落。它包括许多生物类别，如细菌、真菌、藻类、原生动物、轮虫、甲壳动物、线虫、寡毛虫类、软体动物、昆虫幼虫，甚至鱼卵和幼鱼等。近年来，着生生物的研究日益受到重视，其中主要原因是其可以指示水体的污染程度，对河流水质评价效果尤佳。

底栖动物是栖息在水体底部淤泥中、石块或砾石表面及间隙中，以及附着在水生植物之间的肉眼可见的水生无脊椎动物，其体长超过2mm，亦称底栖大型无脊椎动物。它们广泛分布在江、河、湖、水库、海洋和其他各种小水体中，包括水生昆虫、大型甲壳类、软体动物、环节动物、圆形动物、扁形动物等许多动物门类。底栖动物的移动能力差，故在正常环境下、比较稳定的水体中种类比较多，每个种类的个体数量适当，群落结构稳定。当水体受到污染后，其群落结构便发生变化。严重的有机污染和毒物的存在，会使多数较为敏感的种类和不适应缺氧环境的种类逐渐消失，而仅保留耐污染种类，成为优势种类。应用底栖动物对污染水体进行监测和评价，已被各国广泛应用。

在水生食物链中，鱼类代表着最高营养水平。凡能改变浮游动物和大型无脊椎动物生态平衡的水质因素，也能改变鱼类种群，同时，由于鱼类和无脊椎动物的生理特点不同，某些污染物对低等生物可能没有明显作用，但鱼类却可能受到影响。因此，鱼类的状况能够全面反映水体的总体质量。进行鱼类生物调查对评价水质具有重要意义。例如：胭脂鱼是上海土著鱼，对水中的溶解氧和重金属的敏感度较高，水质可影响它的生理指标、生长指标和死亡率。将其投放到苏州河中，通过对其体征状态的监测，可以起到监测水质的作用。又如，德国在莱茵河治理过程中，治理目标是“让大麻哈鱼重返莱茵河”，故将大麻哈鱼作为指示生物，检验河流生态恢复的效果。

在清洁的河流、湖泊、池塘中，有机质含量少，微生物也很少，但受到有机物污染后，微生物数量大量增加，所以水体中含微生物的多少可以反映水体被有机物污染的程度。

当水体污染严重时，选择能在溶解氧较低的环境中生活的颤蚓类、细长摇蚊幼虫、纤毛虫、绿色裸藻等作指示生物，其中颤蚓类是有机物严重污染水体的优势种，数量越多，水体污染越严重。如美国在伊利湖污染的调查中，利用湖中颤蚓数量作为评价指标，根据单位面积的水体中颤蚓数量将受污染水域分为无污染、轻度污染、中度污染和重度污染。监测数据见表6-3。

表6-3 美国伊利湖污染调查监测数据（以颤蚓数量作为评价指标）

水体中度污染的指示生物有瓶螺、轮虫、被甲栅藻、环绿藻、脆弱刚毛藻等，它们对低溶解氧有较好的耐受能力，常在中度有机物污染的水体中大量出现。

清洁水体指示生物有蚊石蚕、蜻蜓幼虫、田螺、浮游甲壳动物、簇生枝竹藻等，只能在溶解氧很高、未受污染的水体中大量繁殖。

2.生物指数监测法

生物指数是指运用数学公式计算出的反映生物种群或群落结构变化、用以评价环境质量的数值。常用的生物指数有如下几种：

（1）贝克生物指数。

贝克（Beck）于1955年首先提出一个简易的计算生物指数的方法，并依据该指数的大小来评价水体污染程度。他把从采样点采到的底栖大型无脊椎动物分为两类，即不耐有机物污染的敏感种和耐有机物污染的耐污种，按下式计算生物指数：

生物指数（BI）＝2A＋B

式中：A、B——敏感种数和耐污种数。

当BI＞10时，为清洁水域；BI为1～6时，为中等污染水域；BI＝0时，为严重污染水域。

（2）贝克-津田生物指数。

1974年，津田松苗在对贝克生物指数进行多次修改的基础上，提出不限于在采样点采集，而是在拟评价或监测的河段把各种底栖大型无脊椎动物尽量采到，再用贝克生物指数公式计算，所得数值与水质的关系为：BI≥20，为清洁水区；10＜BI＜20，为轻度污染水区；6＜BI≤10，为中等污染水区；0＜BI≤6，为严重污染水区。

（3）生物种类多样性指数。

马格利夫（Margalef）、沙农（Shannon）、威尔姆（Willam）等根据群落中生物多样性的特征，经对水生指示生物群落、种群的调查和研究，提出用生物种类多样性指数评价水质。该指数的特点是能定量反映群落中生物的种类、数量及种类组成比例变化信息。

①Margalef多样性指数计算式为：

式中：d——生物种类多样性指数；

N——各类生物的总个数；

S——生物种类数。

d值越低污染越重，d值越高水质越好。其缺点是只考虑种类数与个体数的关系，没有考虑个体在种类间的分配情况，容易掩盖不同群落种类和个体的差异。

②Shannon-Willam根据对底栖大型无脊椎动物的调查结果，提出用底栖大型无脊椎动物种类多样性指数（Shannon多样性指数）来评价水质。其计算式为：

式中：——底栖大型无脊椎动物种类多样性指数；

N——单位面积样品中收集到的各类底栖大型无脊椎动物的总个数；

ni——单位面积样品中收集到的第i种底栖大型无脊椎动物的个数；

S——单位面积样品中收集到的底栖大型无脊椎动物种类数。

上式表明动物种类越多，d值越大，水质越好；反之，动物种类越少，d值越小，水体污染越严重。Willam对美国十几条河流进行了调查，总结出d值与水样污染程度的关系如下：

＜1.0，严重污染；为1.0～3.0，中等污染；＞3.0，清洁。

采用底栖大型无脊椎动物种类多样性指数（）来评价水域被有机物污染状况是比较好的方法，但由于影响（）变化的因素是多方面的，如生物的生理特性、水中营养盐的变化等，故将其与各种生物数量的相对均匀程度及化学指标相结合，才能获得更可靠的评价结果。

（4）硅藻生物指数。

用作计算生物指数的生物除底栖大型无脊椎动物外，也有用浮游藻类的，如硅藻生物指数：

式中：A——不耐污染藻类的种类数；

B——广谱性藻类的种类数；

C——仅在污染水域才出现的藻类的种类数。

万佳等1991年提出，硅藻生物指数0～50为多污带；50～100为α-中污带；100～150为β-中污带；150～200为寡污带。

3.PFU微型生物群落监测法（简称PFU法）

（1）方法原理。

微型生物是指水生生态系统中在显微镜下才能看到的微小生物，包括细菌、真菌、藻类、原生动物和微型后生动物等。它们彼此间有复杂的相互作用，在一定的生境中构成特定的群落，其群落结构特征与高等生物群落相似。当水环境受到污染后，群落的平衡被破坏，种类数减少，多样性指数下降，随之结构、功能参数发生变化。

PFU法是美国Cairns博士1969年创立的。我国于1991年颁布（GB/T 12990—91）。该方法是以聚氨酯泡沫塑料块（PFU）作为人工基质沉入水体中，经一定时间后，水体中大部分微型生物种类均可群集到PFU内，达到种类数的平衡，通过观察和测定该群落结构与功能的各种参数来评价水质状况。还可以用毒性试验方法预报废（污）水或有害物质对受纳水体中微型生物群落的毒害强度，为制定安全浓度和最高允许浓度提出群落级水平的基准。

（2）测定要点。

监测江、河、湖、塘等水体中微型生物群落时，将用细绳沿腰捆紧并有重物垂吊的PFU悬挂于水中采样，根据水环境条件确定采样时间，一般在静水中采样约需4周，在流水中采样约需2周；采样结束后，带回实验室，把PFU中的水全部挤于烧杯内，用显微镜进行微型生物群落观察和活体计数。国家推荐标准（GB/T 12990—91）中规定镜检原生动物，要求看到85％的种类；若要求测定种类多样性指数，需取水样于计数框内进行活体计数观察。

进行毒性试验时，可采用静态式，也可采用动态式。静态毒性试验是在盛有不同毒物[或废（污）水]浓度的试验盘中分别挂放空白PFU和种源PFU，后者在盘中央（每盘放一块），前者（每盘放八块）在后者的周围，并均与其等距；将试验盘置于玻璃培养柜内，在白天开灯、天黑关灯的环境中试验，于第1、3、7、11、15天取样镜检。种源PFU是在无污染水体中已放数天，群集了许多微型生物种类的PFU，它群集的微型生物群落已接近平衡期，但未成熟。动态毒性试验是用恒流稀释装置配制不同废（污）水（或毒物）浓度的试验溶液，分别连续滴流到各挂放空白PFU和种源PFU的试验槽中，在第0.5、1、3、7、11、15天取样镜检。

（3）结果表示。

微型生物群落观察和测定结果可用表6-4所列结构参数和功能参数表示。表中分类学参数是通过种类鉴定获得的，非分类学参数是用仪器或化学分析法测定后计算出的。群集过程三个参数的含义是：Seq为群落达平衡时的种类数；G为微型生物群集速率常数；T90％为达到90％Seq所需时间。利用这些参数即可评价污染状况。例如：清洁水体的异养性指数在40以下；污染指数与群落达平衡时的种类数Seq成负相关，与群集速率常数G成正相关等。还可通过试验获得Seq与毒物浓度之间的相关公式，并据此获得有效浓度（EC5、EC20、EC50）和预测毒物最大允许浓度（MATC）。

表6-4 微型生物群落观察和测定结果

（三）生物测试法

利用生物受到污染物危害或毒害后所产生的反应或生理机能的变化来评价水体污染状况，确定毒物安全浓度的方法称为生物测试法。该方法有静水式生物测试和流水式生物测试两种。前者是把受试生物放于不流动的试验溶液中，测定污染物的浓度与生物中毒反应之间的关系，从而确定污染物的毒性；后者把受试生物放于连续或间歇流动的试验溶液中，测定污染物浓度与生物反应之间的关系。测试分为短期（不超过96h）的急性毒性试验和长期（如数月或数年）的慢性毒性试验。在一个试验装置内，测试生物可以是一种，也可以是多种。测试工作可在实验室内进行，也可在野外污染水体中进行。

1.水生生物毒性试验

进行水生生物毒性试验可用鱼类、溞类、藻类等，其中鱼类毒性试验应用较广泛。

鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定浓度或强度时，就会引起系列中毒反应。例如：行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变，直至死亡。鱼类毒性试验的主要目的是寻找某种毒物或工业废水对鱼类的半数致死浓度与安全浓度，为制定水质标准和废水排放标准提供科学依据；测试水体的污染程度和检查废水处理效果等。有时鱼类毒性试验也用于一些特殊目的，如比较不同化学物质毒性的高低，测试不同种类鱼对毒物的相对敏感性，测试环境因素对废水毒性的影响等。下面介绍静水式鱼类急性毒性试验。

（1）供试验鱼的选择和驯养。

金鱼来源方便，常用于试验。要选择无病、活泼、鱼鳍完整舒展、食欲和逆水性强、体长（不包括尾部）约3cm的同种和同龄的金鱼。选出的鱼必须先在与试验条件相似的生活条件（温度、水质等）下驯养7d以上；试验前一天停止喂食；如果在试验前四天内发生死亡现象或发病的鱼高于10％，则不能使用。

（2）试验条件选择。

每种浓度的试验溶液为一组，每组至少10条鱼。试验容器用容积约10L的玻璃缸，保证每升水中鱼质量不超过2g。

试验溶液的温度要适宜，对冷水鱼为12～28℃，对温水鱼为20～28℃。同一试验中，温度变化为±2℃；试验溶液中不能含大量耗氧物质，要有足够的溶解氧，对冷水鱼DO≥5mg/L，对温水鱼DO≥4mg/L；试验溶液的pH应为6.7 8.5，试验期间pH波动范围不得超过0.4个pH单位；硬度影响毒物毒性，一般来说，硬水可降低毒物毒性，而软水可增强毒物毒性，因此，必须注意检测试验溶液的硬度，并在报告中注明。硬度应为50～250mg/L（以CaCO3计）。

配制试验溶液和驯养鱼用的水应是未受污染的河水或湖水。如果使用自来水，必须经充分曝气才能使用。不宜使用蒸馏水。

（3）试验步骤。

①预试验（探索性试验）：为保证正式试验顺利进行，须经探索性试验确定试验溶液的浓度范围，即通过观察24h（或48h）鱼类中毒的反应和死亡情况，找出不发生死亡、全部死亡和部分死亡的浓度。

②试验溶液浓度设计：合理设计试验溶液浓度，是试验成功的重要保证，通常选7个浓度（至少5个），浓度间隔取等对数间距，例如：10.0、5.6、3.2、1.8、1.0（对数间距0.25）或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0（对数间距0.1），其单位可用体积分数（如废水）或质量浓度（mg/L）表示。另设一对照组，对照组在试验期间鱼死亡率超过10％，则整个试验结果不能采用。

③试验：将试验用鱼分别放入盛有不同浓度溶液和对照水的玻璃缸中，并记录时间。前8h要连续观察和记录试验情况，如果正常，继续观察，记录24h、48h和96h鱼的中毒症状和死亡情况，供判定毒物或工业废水的毒性。

④毒性判定：半数致死量（LD50）或半数致死浓度（LC50）是评价毒物毒性的主要指标之一。鱼类急性毒性的分级标准如表6-5所示。求LC50的简便方法是将试验用鱼死亡半数以上和半数以下的数据与相应试验溶液毒物（或废水）浓度绘于半对数坐标纸上（对数坐标表示毒物浓度，算术坐标表示死亡率），用直线内插法求出。表6-6列出假设某废水的试验结果，图6-1为利用试验结果求LC50的方法（直线内插法）。将三种试验时间试验鱼死亡半数以上和半数以下最接近半数的死亡率数值与相应废水浓度数值的坐标交点标出，并分别连接起来，再由50％死亡率处引一横坐标的垂线，与上述三线相交，由三交点分别向纵坐标作垂线，垂线与纵坐标的交点处浓度即为LC50，可见24h、48h和96h的LC50分别为5.2％、4.7％、4.4％。

表6-5 鱼类急性毒性的分级标准

图6-1 利用试验结果求LC50的方法（直线内插法）

表6-6 假设某废水的试验结果

⑤鱼类毒性试验的应用：鱼类毒性试验的一个重要目的是根据试验数据估算毒物的安全浓度，为制定有毒物质在水中的最高允许浓度提供依据。计算安全浓度的经验公式有以下几种：

目前应用比较普遍的是最后一种。对易分解、积累少的化学物质一般选用的系数为0.05～0.1，对稳定的、能在鱼体内高积累的化学物质，一般选用的系数为0.01～0.05。

按公式计算出安全浓度后，要进一步做验证试验，特别是具有挥发性和不稳定性的毒物或废水，应当用恒流装置进行长时间（如一个月或几个月）的验证试验，并设对照组进行比较，如发现有中毒症状，则应降低毒物或废水浓度再进行试验，直到确认某浓度对鱼是安全的，即可定为安全浓度。此外，在验证试验过程中必须投喂饵料。

2.发光细菌法

（1）方法原理。

发光细菌是一类非致病的革兰氏阴性微生物，它们在适当条件下能发射出肉眼可见的蓝绿色光（450～490nm）。当样品毒性组分与发光细菌接触时，可影响或干扰细菌的新陈代谢，使细菌的发光强度下降或不发光。在一定毒物浓度范围内，毒物浓度与发光强度成负相关线性关系，因而可使用生物发光光度计测定水样的相对发光强度来监测毒物的浓度。

国家标准（GB/T 15441—1995）中，以氯化汞作为参比毒物表征废水或可溶性化学物质的毒性，也可用半数有效浓度（EC50），即发光强度为最大发光强度一半时的废水浓度或可溶性化学物质的浓度来表征；选用明亮发光杆菌T3亚种（Photobacterium phosphoreum T3spp.）作为发光细菌。因该菌是一种海洋细菌，故水样和参比毒物溶液应含有一定浓度的氯化钠。

目前，常采用新鲜发光细菌培养法和冷冻干燥发光菌粉制剂法。

（2）测定要点。

①试验材料的准备：专用生物毒性测试仪，发光细菌琼脂培养液、液体培养基，0.02～0.24mg/L系列HgCl2标准溶液，新鲜明亮发光杆菌T3亚种或明亮发光杆菌冻干粉，化学毒物或综合废水等。

②新鲜发光细菌悬液的制备：从明亮发光杆菌的菌种管斜面中挑取一环细菌接种于新的发光细菌琼脂斜面上，待斜面长满菌苔并明显发光时加入适量稀释液并制成菌悬液；取0.1mL菌悬液接种于50mL液体培养基中，在22℃摇床振荡培养至对数生长中期（12～14h），用稀释液将菌悬液稀释成5×107个（细胞）/[mL（菌悬液）]，置于4℃下保存备用。(www.chuimin.cn)

③样品测定：将过滤去除颗粒物杂质的待测水样加入占水样质量3％的NaCl，然后按表6-7所示依次加入稀释液和待测水样，恒温（20±0.5）℃后加入等量发光细菌悬液，依次测其发光强度。

表6-7 工业废水发光强度标准系列

注：①为空白样品，其他均为待测样品。

④测试结果分析：根据测得的待测水样的发光强度计算其相对折光率，计算公式为：

式中：对照光强度——水样中废水浓度为0的1号测试管中测得的发光强度。

EC50：在双对数坐标纸上，以水样浓度为横坐标，以相对折光率为纵坐标作图，由图求得水样的EC50，并对照表6-8确定水样的生物毒性。

表6-8样品EC50与生物毒性的关系

注：①指废水不经稀释时，发光强度仍大于最大发光强度的50％以上。

3.致突变和致癌物检测

致突变和致癌物也称诱变剂，其检测方法有微核测定法、艾姆斯（Ames）试验法、染色体畸变试验法等。

微核测定法原理基于：生物细胞中的染色体在复制过程中常会发生一些断裂，在正常情况下，这些断裂绝大多数能自行愈合，但如果受到外界诱变剂的作用，就会产生一些游离染色体断片，形成包膜，变成大小不等的小球体（微核），其数量与外界诱变剂强度成正比，可用于评价环境污染水平和对生物的危害程度。该方法所用生物材料可以是植物或动物组织或细胞。植物广泛应用紫露草和蚕豆根尖。紫露草以其花粉母细胞在减数分裂过程中的染色体作为诱变剂的攻击目标，把四分体中形成的微核数作为染色体受到损伤的指标，评价受危害程度。蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量多，对诱变剂反应敏感。

Ames试验是利用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型菌株发生回复突变的性能来检测被检物是否具有致突变性。这种菌株均含有控制组氨酸合成的基因，在不含组氨酸的培养基中不能生长，但如果存在致突变物时，便作用于菌株的DNA，使其特定部位发生基因突变而回复为野生型菌株，能在无组氨酸的培养基中生长。考虑到许多物质是在体内经代谢活化后才显示出致突变性的，Ames等人采用了在体外加入哺乳动物肝微粒体酶系统（简称S-9混合液）使被检物活化的方法，提高了试验的可靠性。

染色体畸变试验是依据生物细胞在诱变剂的作用下，其染色体数目和结构发生变化，如染色单体断裂、染色单体互换等，以此检测诱变剂及其强度。

（四）叶绿素a的测定

叶绿素是植物光合作用的重要光合色素，常见的有叶绿素a、b、c、d四种类型，其中叶绿素a是一种能将光合作用的光能传递给化学反应系统的唯一色素，叶绿素b、c、d等吸收的光能均是通过叶绿素a传递给化学反应系统的。通过测定叶绿素a，可掌握水体的初级生产力，了解河流、湖泊和海洋中浮游植物的现存量。试验表明，当叶绿素a质量浓度升至10mg/m3以上并有迅速增加的趋势时，就可以预测水体即将发生富营养化。因此，可将叶绿素a含量作为评价水体富营养化并预测其发展趋势的指标之一。

叶绿素a的测定方法有高效液相色谱法、分光光度法和荧光光谱法。高效液相色谱法精确度高，但操作步骤烦琐。目前最常用的是分光光度法和荧光光谱法。

1.分光光度法测定叶绿素a

（1）基本原理。

叶绿素a的最大吸收峰位于663nm，在一定浓度范围内，其吸光度与其浓度符合朗伯-比尔定律，可根据吸光度-浓度之间的线性关系，计算叶绿素a的浓度。叶绿素b、叶绿素c和提取液浊度的干扰可通过分别在645nm、630nm和750nm处测得的吸光度校正。水样中的浮游植物采用过滤法富集，用有机溶剂提取其中的叶绿素。

根据所用提取液的不同，叶绿素a的分光光度法测定可分为丙酮法、甲醇法和乙醇法等。我国一直沿用丙酮法。近年来国际上从萃取效果和安全保障等方面考虑，已逐渐改用乙醇法。

（2）测定方法及要点。

①丙酮法：该方法适合于藻类繁殖比较旺盛的水样和表面附着的藻类。

a.样品的制备及叶绿素的提取：离心或过滤浓缩水样，用质量分数为90％的丙酮溶液提取其中的叶绿素。

将一定量的水样用乙酸纤维滤膜过滤，将收集有浮游植物的滤膜于冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器，加入少量碳酸镁粉末及2～3mL质量分数为90％的丙酮溶液，充分研磨，提取叶绿素a，离心，取上清液。重复提取1～2次，离心所得上清液合并于容量瓶，用质量分数为90％的丙酮溶液定容（5mL或10mL）。

b.测定：取上清液于1cm比色皿中，以质量分数为90％的丙酮溶液为参比，分别读取750nm、663nm、645nm和630nm的吸光度。

c.计算：叶绿素a的质量浓度按如下公式计算：

式中：V——水样体积，L；

A——吸光度；

V1——离心并合并后上清液定容的体积，m L；

δ——比色皿光程，cm。

②乙醇法：其测定原理与丙酮法相同，不同的是以体积分数为90％的热乙醇溶液提取样品中的叶绿素。方法要点如下：

a.样品制备：过滤一定体积（V）的水样，将滤膜向内对折，于﹣20℃的冰箱中至少保存一昼夜。

b.叶绿素提取：从冰箱中取出样品，立即加入约4mL体积分数为90％的热乙醇溶液，80～85℃水浴保温2min后于室温下避光萃取4～6h，玻璃纤维滤膜过滤，收集滤液并定容至10mL（V1）。

c.测定：以体积分数为90％的热乙醇溶液为参比，分别测定样品在665nm和750nm的吸光度A665和A750，然后在样品中加入1mol/L的盐酸酸化，混匀， 1min后重新测定前面两个波长处的吸光度A＇665和A750。

d.计算：样品中的叶绿素a质量浓度按下式进行计算：

ρ（叶绿素a）（mg/m3）＝27.9V1×[（A665－A750）－（A＇665－A＇750）]/V

2.荧光光谱法测定叶绿素a

方法原理：当丙酮提取液用436nm的紫外线照射时，叶绿素a可发射670nm的荧光，在一定浓度范围内，发射荧光的强度与其浓度成正比，因此，可通过测定样品丙酮提取液在436nm紫外线照射时产生的荧光强度，定量测定叶绿素a的含量。

该方法灵敏度比分光光度法高约两个数量级，适合于藻类比较少的贫营养化湖泊或外海中叶绿素a的测定。但是分析过程中易受其他色素或色素衍生物的干扰，并且不利于野外快速测定。

（五）微囊藻毒素的测定

1.微囊藻毒素的毒性和结构

水体中产毒藻类主要为蓝藻，如微囊藻、鱼腥藻和束丝藻等，其中，微囊藻可产生肝毒素，导致腹泻、呕吐、肝肾等器官的损坏，并有促瘤致癌作用；鱼腥藻和束丝藻可产生神经毒素，损害神经系统，引起惊厥、口舌麻木、呼吸困难，甚至呼吸衰竭。微囊藻毒素（microcystin，简称MC）是蓝藻产生的一类天然毒素，是富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素，也是毒性较大、危害最严重的一种。目前已发现的微囊藻毒素有70多种，其中微囊藻毒素-LR是最常见、毒性最大的一种，结构如图6-2所示。

世界卫生组织（WHO）在《饮用水水质标准》（第二版）中规定，微囊藻毒素-LR在生活饮用水中的限值为1μg/L。我国现行的《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2006）和《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）中均规定微囊藻毒素-LR的限值为0.001mg/L。

图6-2 微囊藻毒素-LR的结构

2.微囊藻毒素的检测方法

目前常用的微囊藻毒素的检测方法有生物（生物化学）测试法和物理化学检测法两类，其不同点在于检测原理、样品预处理的复杂程度，以及检测结果的表达形式。微囊藻毒素的几种检测方法的比较列于表6-9。

表6-9 微囊藻毒素的几种检测方法的比较

续表

我国在《水中微囊藻毒素的测定》（GB/T 20466—2006）中规定采用高效液相色谱（HPLC）法和间接竞争酶联免疫吸附法测定饮用水、湖泊水、河水及地表水中的微囊藻毒素。《生活饮用水标准检验方法 有机物指标》（GB/T 5750.8—2006）中也规定采用高效液相色谱法测定生活饮用水及其水源水中的微囊藻毒素。以下介绍高效液相色谱法。

（1）原理。

水样中的微囊藻毒素经反相硅胶柱萃取（固相萃取）富集后，其各种异构体在液相色谱仪中分离，微囊藻毒素对波长为238nm的紫外线有特征吸收峰，经紫外检测器检测，得到样品中不同的微囊藻毒素异构体的色谱峰和保留时间，与微囊藻毒素标准样品的保留时间比较可确定样品中微囊藻毒素的组成，依据峰面积可计算水样中微囊藻毒素的含量。

藻细胞中的微囊藻毒素经冻融、反相硅胶柱萃取浓缩后，可用高效液相色谱法测定。

（2）测定要点。

①水样的采集与制备：采集1～5L水样，0.45μm滤膜减压过滤，滤液（水样）和藻细胞（膜样）分别进行不同的预处理。

a.水样处理（测水样中的微囊藻毒素）：滤液→过5g ODS柱→依次用50mL去离子水、50mL体积分数为20％的甲醇淋洗杂质→50mL体积分数为80％的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥，残渣溶于10mL体积分数为20％的甲醇→过C18固相萃取小柱→10mL体积分数为100％的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥，残渣溶于1mL色谱纯甲醇→﹣20℃保存，待测。

b.膜样处理（测藻细胞中的微囊藻毒素）：藻细胞（滤膜）→冻融三次→100mL质量分数为5％的乙酸萃取30min→以4 000r/min离心10min，重复三次，合并上清液→上清液过500mg ODS柱→15mL体积分数为100％的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥，残渣溶于10mL体积分数为20％的甲醇→过C18固相萃取小柱→10mL体积分数为100％的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥，残渣溶于1mL色谱纯甲醇→﹣20℃保存，待测。

②测定：

a.色谱条件：高效液相色谱仪（配紫外或二极管阵列检测器），色谱柱（C18反相柱，长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm），柱温（40℃），流动相（甲醇与pH＝3的磷酸盐缓冲溶液的体积比为57∶43，流量为1mL/min）。

b.样品测定：准确取一定体积的待测样品和标准样品，同样条件下进样测定，记录其保留时间和峰面积，并按下式计算样品中微囊藻毒素的含量。标准样品谱图见图6-3。

图6-3 微囊藻毒素MC-RR、MC-YR

和MC-LR标准样品谱图

式中：ρ——水样中微囊藻毒素的质量浓度，μg/L；

ρs——标准样品中微囊藻毒素的质量浓度，μg/L；

A——待测样品峰面积；

As——标准样品峰面积；

V1——待测样品的体积，mL；

V2——水样的体积，mL。

也可配制不同浓度的MC-RR、MC-YR和MC-LR标准溶液，在同样条件下测得各浓度标准样品和待测样品的峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并在标准曲线上查出水样中微囊藻毒素的浓度。

（六）细菌学检验法

细菌能在各种不同的自然环境中生长。地表水、地下水，甚至雨水和雪水都含有多种细菌。当水体受到人畜粪便、生活污水或某些工农业废水污染时，细菌大量增加。因此，水的细菌学检验，特别是肠道细菌的检验，在卫生学上具有重要的意义。但是，直接检验水中各种病原菌，方法较复杂，有的难度大，且结果也不能保证绝对安全。所以，在实际工作中，经常以检验细菌总数，特别是检验作为粪便污染的指示细菌，如总大肠菌群、粪大肠菌群、粪链球菌、肠道病毒等，来间接判断水的卫生学质量。

1.水样采集

采集细菌学检验用水样，必须严格按照无菌操作要求进行；防止在运输过程中被污染，并应迅速进行检验。一般从采样到检验不宜超过2h；在10℃以下冷藏保存不得超过6h。

采集江、河、湖、库等水样，可将采样瓶沉入水面下10～15cm处，瓶口朝水流上游方向，使水样灌入瓶内。需要采集一定深度的水样时，用采水器采集。采集自来水样，首先用酒精灯灼烧水龙头灭菌或用体积分数为70％的酒精消毒，然后放水3min，再采集约为采样瓶容积的80％左右的水量。

2.细菌总数的测定

细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落（CFU）的总数，它是判断饮用水、水源水、地表水等污染程度的标志。我国《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）中规定，每毫升生活饮用水中细菌总数不得超过100个。其主要测定程序如下：

（1）对所用器皿、培养基等按照方法要求进行灭菌。

（2）以无菌操作方法用1mL灭菌吸管吸取混合均匀的水样（或稀释水样）注入灭菌平皿中，倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并旋摇平皿使其混合均匀。每个水样应做两份，还应另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作空白对照。待营养琼脂培养基冷却凝固后，翻转平皿，置于37℃恒温箱内培养24h，然后进行菌落计数。

（3）用肉眼或借助放大镜观察，对平皿中的菌落进行计数，求出1mL水样中的平均菌落数。报告菌落计数时，若菌落数在100以内，按实测数字报告；若大于100，采用两位有效数字，用10的指数来表示。例如：菌落数为37 750个/mL，记作3.8×104个/mL。

3.总大肠菌群的测定

粪便中存在大量的大肠菌群细菌，其在水体中存活时间和对氯的抵抗力等与肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌等）相似，因此，将总大肠菌群作为粪便污染的指示细菌是合适的。但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖。

总大肠菌群是指那些能在35℃、48h内使乳糖发酵产酸、产气、需氧及兼性厌氧的、革兰氏阴性的无芽孢杆菌，以每升水样中所含有的大肠菌群的数目表示。其测定方法有多管发酵法和滤膜法。多管发酵法适用于各种水样（包括底质），但操作较烦琐，耗时较长。滤膜法操作简便、快速，但不适用于浑浊水样。具体测定方法在“环境微生物学”相关课程中已作介绍，在此不再重述。

4.其他粪便污染指示细菌的测定

粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，是指存在于温血动物肠道内的大肠菌群细菌，与测定总大肠菌群不同之处在于将培养温度提高到44.5℃，在该温度下仍能生长并使乳糖发酵产酸、产气的为粪大肠菌群。

沙门氏菌属是常常存在于污水中的病原微生物，也是引起水传播疾病的重要来源。由于其含量很低，测定时需先用滤膜法浓缩水样，然后进行培养和平板分离，最后，进行生物化学和血清学鉴定，确定一定体积水样中是否存在沙门氏菌。

链球菌（通称粪链球菌）也是粪便污染的指示细菌。这种菌进入水体后，在水中不再自行繁殖，这是它作为粪便污染指示细菌的优点。此外，由于人粪便中粪大肠菌群多于粪链球菌，而动物粪便中粪链球菌多于粪大肠菌群，因此，在水质检验时，根据粪大肠菌群与粪链球菌菌数的比值不同，可以推测粪便污染的来源。当该比值大于4时，则认为污染主要来自人粪；若该比值小于或等于0.7，则认为污染主要来自温血动物粪便；若该比值小于4而大于2，则为混合污染，但以人粪为主；若该比值小于或等于2，而大于或等于1，则难以判定污染来源。粪链球菌数的测定也采用多管发酵法或滤膜法。