食品酶学导论：功能性低聚糖的酶法生产

低聚糖（oligosaccharide）是指2～10个单糖单位通过糖苷键联结起来，形成直链或分支链的一类寡糖的总称。人们熟悉的蔗糖、麦芽糖、乳糖、环糊精等均属于此类。但过量摄取蔗糖会引起肥胖、糖尿病、心血管疾病等。当今保健食品热潮兴起，大大促进了新型低聚糖的研究及开发，也促进了新酶源的研究及应用。目前，已发现了多种能催化在特定羟基上产生特殊键合的转移糖酶和具有生成特殊低聚糖能力的新型淀粉酶，为新型低聚糖的生产奠定了基础。同时，基因工程的应用、固定化酶和固定化细胞技术的发展，使得工业上大规模生产新型低聚糖成为可能。

近十多年来，一些发达国家，尤其是日本、欧美等国，与新型低聚糖有关的保健食品得到了迅猛的发展。国际市场低聚糖年总产量达6万t，已广泛应用于饮料、糖果、糕点、乳制品、冷饮、调味料、保健食品等食品产品中。新型低聚糖独特的生理功能已引起了世界各国的关注。我国也已重视这一领域的研究，中国食品发酵研究所、江南大学、华南理工大学等单位正积极开展这一领域的研究，并取得大量基础研究成果。目前，国际上已研究开发成功的新型低聚糖有10多种，主要有：异麦芽低聚糖、蔗果寡糖、半乳糖基寡糖、半乳糖基转移寡糖、帕拉金糖、大豆低聚糖、异构乳糖等。大量研究表明，低聚糖主要具有促进双歧杆菌增殖，抑制腐败菌的生长繁殖，低热能，防止肥胖和糖尿病，抗龋齿和抗肿瘤等生理功能。现将几种新型低聚糖的生理功能列于表11-16。

表11-16 几种新型低聚糖的生理功能

新型低聚糖生产过程，一般包括酶的发酵生产、低聚糖的酶法合成和分离精制三个过程。每个过程都与生物技术和化学工程技术密切相关。微生物酶的发酵生产，可运用现代生物技术对菌种进行基因工程改造，以提高酶活力和产量，运用现代发酵技术和新型生物反应器，达到最优化控制来提高发酵酶的产量。在酶法合成过程中，一般采用固定化酶或固定化菌体来连续合成低聚糖，分离精制过程一般包括过滤、脱色、脱盐、分离、纯化、浓缩等操作过程。

（一）低聚果糖（Fructooligosaccharides）的生产

1.低聚果糖的构成及酶法合成原理

低聚果糖又称为蔗果寡糖（fructosylsucrose），其分子结构是在蔗糖（GF）分子上结合1～3个果糖分子的寡糖的总称。其组成主要是蔗果三糖（GF₂）、蔗果四糖（GF₃）和蔗果五糖（GF₄）。蔗糖与果糖分子以β-1，2-糖苷键连接成为蔗果寡糖。低聚果糖普遍存在于高等植物中，尤其以洋葱、牛蒡、芦笋、香蕉等植物中含量较高。目前，工业生产上是采用β-果糖转移酶（β-fructosyltransferase）或β-呋喃果糖苷酶（β-fructosyltransfidase）催化作用蔗糖，进行分子间果糖转移反应生产低聚果糖。分子间果糖的转移反应分两步进行，如图11-12所示。

图11-12 分子间果糖转移反应的两步机理

Fru-OR：蔗糖

E-H：酶

Fru-E：果糖基-酶复合体

RO-H：葡萄糖

Fru-OH：果糖

Fru-OR′：低聚果糖

在酶法转移合成低聚蔗果寡糖的两步反应中，蔗糖既是供体也是受体。在反应式（11-1）中，蔗糖在β-果糖转移酶或β-呋喃果糖苷酶的作用下分解为果糖基和葡萄糖，为反应式（11-2）、式（11-3）两个反应提供果糖基。在反应式（11-2）中果糖基加水合成果糖，在反应式（11-3）中蔗糖作为受体和果糖基作用合成蔗果三糖，蔗果三糖作为受体则合成蔗果四糖，蔗果四糖作为受体则合成蔗果五糖。从低聚果糖酶法合成两步反应可知，反应液是由葡萄糖、果糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和剩余蔗糖所组成的混合糖浆。各组分的含量取决于酶的特性和反应条件控制（如蔗糖浓度、反应时间等）。工业生产的目的是希望蔗果寡糖含量越高越好。反应式（11-1）是低聚果糖生产的必经步骤，因此，葡萄糖的存在是不可避免的，关键是如何抑制反应式（11-2）的果糖基加水反应，同时促进反应式（11-3）的蔗果寡糖的生成。这主要取决于酶的亲和特性与基料的浓度，若酶偏向于亲和蔗糖、蔗果三糖等，则有利于反应式（11-3）的进行。此外，通过提高底物浓度，可以促进反应式（11-3）的进行，同时也可抑制反应式（11-2），从而达到生产高含量低聚果糖的目的。

2.果糖基转移酶及其微生物来源

低聚果糖生产中一个关键性的问题是催化果糖转移酶的选择。工业上均采用微生物发酵生产果糖转移酶或β-呋喃果糖苷酶，这些微生物包括细菌、霉菌、酵母菌等。一般酵母菌所产的果糖转移酶，在催化果糖转移反应的初期，产生以蔗果三糖为主的数种低聚糖。由于酵母菌所产生的果糖转移酶水解活性较强，反应后期又会水解蔗果寡糖，从而导致最终产物中低聚果糖含量低。因此，工业生产采用的果糖转移酶通常是由霉菌来发酵生产的。

目前，低聚果糖酶的优良菌株有：Aureobasidiumpullueans，Aspergillus niger ATCC 200611，NRRL4337，ATCC9612，Aspergillus japonicis TIT-KJI，Aspergillus orgzae，Aspergillus phoenicis CBS 294.80等，以上均为霉菌属。属于细菌类的生产菌有Arthrobacter SPK-1。以上生产菌及其酶的特性和合成低聚果糖的主要成分如表11-17所示。表中除了Aspergillus phoenicis菌株生产的酶为果糖转移酶以外，其他均为β-呋喃果糖苷酶。华南理工大学、中国食品发酵工业研究所、江南大学等单位从多种黑曲霉中筛选到了产β-呋喃果糖苷酶的菌株，已开展了相关酶学应用的基础研究。

表11-17 β-呋喃果糖苷酶的特性比较

3.低聚果糖的工业化生产

低聚果糖生产工艺流程图如图11-13所示。

（1）果糖转移酶的发酵生产 选定合适的产酶菌株后，由斜面种子逐级扩大培养，并进行发酵产酶。其发酵培养基：蔗糖10%～20%，K₂HPO₄0.1%～0.15%，MgSO₄· 7H₂O 0.15%～0.20%。在28～30℃条件下通气搅拌培养3～4d，即可生产出含有果糖转移酶活力的菌体。由于转移酶属于胞内酶，大部分酶在菌体内。一般将菌体分离后，直接对菌体进行固定化，也可以将菌体细胞破碎后，分离纯化出果糖转移酶后再进行固定化处理。

（2）菌体或酶的固定化 固定化方法一般采用海藻酸钠包埋法进行菌体或酶的固定化。将海藻酸钠配成6%～8%的溶液，经消毒处理后，将湿菌体或酶按比例和配制好的海藻酸溶液在真空条件下混合均匀，然后用压力喷射的方法把混合液通过孔径为0.6mm的喷嘴，均匀喷入0.5mol/L的CaCl₂溶液中，使其形成凝胶珠（直径介于2～3mm），硬化20～30min，过滤分离得到固定化菌体或固定化酶，充填到固定化床柱或流化床生物反应器中。

图11-13 低聚果糖生产工艺流程简图

1-种子斜面培养 2-种子扩大培养 3-酶的发酵生产 4-酶或菌体分离器5-真空搅拌混合器 6-造粒机 7-分离器 8-固定化的果糖转移酶或固定化细胞9-暂贮罐 10-加热器11-固定化酶或固定化细胞反应器 12-活性炭柱13-离子交换柱 14-活性炭再生柱 15-浓缩器

（3）酶催化合成低聚果糖 将50%～60%的蔗糖溶液流经装有固定化菌株或固定化酶的生物反应器。反应时间控制在24～30h，流速应根据酶活力来控制。温度和pH应根据所选择的菌株所产酶的特性来确定。在酶法合成低聚果糖的过程中，蔗糖浓度对于低聚果糖转化率有很大的影响，在低浓度条件下，低聚果糖转化率低，在低于5%的浓度下几乎不生成低聚果糖，而将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。随着蔗糖浓度的提高，低聚果糖转化率提高。我国台湾段国仁将Aspergillus japonicus TIJ-KJI发酵生产的β-呋喃果糖苷酶添加到不同浓度的蔗糖溶液中，研究结果表明，蔗糖溶液浓度低于30%，有部分水解反应生成果糖；蔗糖溶液浓度达到50%，几乎全部发生转移反应，而不发生水解反应。工业生产考虑到粘度和渗透压的影响，一般选用的糖液浓度为50%～60%。该菌产生的酶促合成低聚果糖的过程如图11-14所示。

用酶法合成的低聚果糖，含量一般仅为40%～55%，原因在于酶法合成低聚果糖的同时生成了副产物葡萄糖。葡萄糖既是平衡产物，又是酶的抑制物，它阻遏了底物蔗糖的进一步转化，因而产品中仍含有相当数量的葡萄糖和未作用的蔗糖。目前，消除葡萄糖的抑制作用，提高低聚果糖含量的方法主要有：①在反应物中加入葡萄糖氧化酶和CaCO₃，将葡萄糖氧化为葡萄糖酸；②利用酵母同化单糖快于同化低聚果糖，在产物中加入酵母菌，以消除单糖的抑制作用；③将葡萄糖氧化酶和果糖转移酶或含果糖转移酶的活菌体共固定化，来达到消除葡萄糖的抑制作用。这样便可以使低聚果糖的含量由原来的50%左右提高到70%以上。

（4）纯化工序 从固定化生物反应器流出的混合糖浆先经活性炭柱脱色处理，然后再经阴-阳离子交换树脂脱除盐分，再经真空浓缩到固形物含量为75%的液体糖浆，其中低聚果糖含量占总含量50%左右。也可以根据市场要求进一步除去混合糖浆中的葡萄糖和蔗糖，使低聚果糖含量提高。目前，日本有低聚果糖占总固形物含量95%的糖浆，也有粉末状或颗粒状的产品销售。

图11-14 利用Aspergillus japonicus NTU-1249产生的酶促合成低聚果糖的过程

蔗糖浓度50%，酶加入量5.6U/g蔗糖，pH5.0，温度50℃。FOS：总的低聚果糖GF₂：蔗果三糖GF₃：蔗果四糖GF₄：蔗糖五糖G：葡萄糖

（二）异麦芽寡糖的生产(www.chuimin.cn)

异麦芽寡糖（Isomaltooligosaccharides）为直链麦芽寡糖分子中具有支状键合的双糖和寡糖，因此又称为分支低聚糖（branching oligosaccharide）。分子中除了 α-1，4-糖苷键以外，尚含有α-1，6-糖苷键及α-1，3-糖苷键等分支状结合方式，其结构如图11-15所示，其主要成分为异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖。其次还含有异麦芽四糖、具有 α-1，3-糖苷键的黑曲糖及具有α-1，2-糖苷键的曲二糖等。如日本昭和产业公司生产的异麦芽糖浆IMO-550及粉状异麦芽糖IMO-900P、林原商事的“巴罗莱夫”、日本食品化工的生物糖（biotose）50和日本资粮工业的异麦芽糖（ISO-G）等产品。

图11-15 麦芽寡糖与异麦芽寡糖的结构

○-葡萄糖单元 ●-还原端的葡萄糖单元

异麦芽糖生产中最关键的酶是α-葡萄糖苷酶，许多霉菌生产的α-葡萄糖苷酶可进行α-1，6-键葡萄糖苷转移反应。如黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等所产的α-葡萄糖苷酶作用于30%的麦芽糖，可生成含量超过60%的异麦芽寡糖。我国目前也正在开展有关的研究，江南大学的金其荣、徐勤等研究报道了从土壤中筛选出一株产α-葡萄糖苷酶的Asperillus sp.BICo2菌株，以新鲜麸曲（干基），酶作用最适pH5.3，最适温度55℃，Mg^{2 +}、Ca^{2 +}能激活该酶。用该酶生产的异麦芽糖浆其成分组成类似日本的IMO-500。

图11-16 异麦芽寡糖生产工艺流程

工业化生产异麦芽寡糖以淀粉为原料，将淀粉调配成25%～30%的淀粉浆，添加 α-淀粉酶液化，液化DE值控制在6～10，再加β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，在pH5～6，温度55～60℃糖化10h左右，然后灭酶、过滤和精制处理。日本生产异麦芽寡糖的工艺流程如图11-16所示。此外，异麦芽寡糖生产也可以由淀粉制得高浓度的葡萄糖浆（80%左右），在较高温度下（70℃左右）利用固定化葡萄糖淀粉酶逆向合成异麦芽寡糖。异麦芽寡糖具有适口的甜味，甜度约为蔗糖的50%，黏度和蔗糖相近，具有良好的保湿性和抗结晶性，可防止淀粉老化，而且具有一定的双歧杆菌增殖效果和抗龋齿能力，耐热、耐酸性强，因此，异麦芽寡糖具有良好的加工特性和保健生理功能，替代部分蔗糖应用于饮料、冷饮、果糖、乳制品、糕点、焙烤等食品中，是目前世界上生产量最大（约2000万t）、价格最便宜的一种新型低聚糖。

（三）低聚半乳糖（Galatooligosaccharides）的生产

低聚半乳糖是在乳糖分子的半乳糖基以β-1，4、β-1，6糖苷键连接2～3个半乳糖分子的寡糖类混合物。低聚半乳糖是以乳糖为原料，由β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）进行半乳糖转移反应来生产。乳糖是半乳糖残基供给体，同时也是接受体，其合成原理和低聚果糖酶法合成相类似。这种糖首先是由日本的Yakult公司生产的，该公司于1988年利用一株米曲霉（Asp.oryzae）生产的β-半乳糖苷酶作用于乳糖工业化生产低聚半乳糖，其后荷兰Borculo公司利用大量的乳糖来生产低聚半乳糖，应用于乳制品、婴儿食品、糖果和饮料等食品，该公司生产的低聚半乳糖浆的组成为：低聚半乳糖58%～65%，乳糖21%～28%，葡萄糖20%～23%，半乳糖1%～4%，固形物≥75%，甜度约为蔗糖的30%。

β-半乳糖苷酶也称乳糖酶（lactase，EC 3.2.1.23），它能将乳糖水解为葡萄糖及半乳糖，也能将水解下来的半乳糖苷转移到乳糖分子上。细菌、真菌、放线菌等微生物均可产生这种酶，如乳酸菌（Lactobacillus）、芽孢杆菌（Bacillus circulans）、大肠杆菌（E.coli）、米曲霉（Asp.oryzae）、黑曲霉（Asp.niger）、琉球曲霉（Asp.luchuensis）、脆壁克鲁维酵母（Kluyvero-myces fragilis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、乳酸酵母（Saccharomeces lactis）、产朊假丝酵母（Cancideautilis）、天蓝色链霉（Streptomyces celicolar）等。但是只有米曲霉和环状芽孢杆菌产的β-半乳糖苷酶可以合成三聚及三聚以上的低聚半乳糖，而黑曲霉和大肠杆菌产的β-半乳糖苷酶以合成双糖为主。

目前，工业化生产低聚半乳糖多采用固定化酶的方法连续生产。据报道，利用乙二醛（Glutaldehyde）活化离子交换树脂固定β-半乳糖苷酶，进行低聚半乳糖的连续化生产，在pH4.5～5.0，55℃条件下，反应半衰期高达192d。

低聚半乳糖为难消化性低聚糖，据测定其产热能仅为7.1kJ/g，其热值远低于蔗糖，具有良好的双歧杆菌的增殖效果，能改善便秘，抑制肠内腐败菌的生长，此外，还有一定程度的抗龋齿性和改善脂质代谢的效果。一般，每日摄入3～10g低聚半乳糖便能显现以上各种生理功能。低聚半乳糖耐热性强，对酸稳定，在食品加工中得到广泛应用。

20世纪90年代初，日本成功地研究开发出α-低聚半乳糖，它是先将乳糖用β-半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖的混合物，通过添加α-半乳糖苷酶使之进行缩合反应生产的。蜜二糖是α-低聚牛乳糖的主要成分，为半乳糖与葡萄糖以 α-1，6键结合的低聚糖。α-半乳糖苷酶是从土壤中分离得到的季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）中获得的。蜜二糖具有很强的双歧杆菌增殖功能，耐热性、耐酸性好。此外，利用 α-半乳糖苷转移酶的作用还可将α-低聚半乳糖作为合成各种含有α-半乳糖基的生理活性物质和化学物质及基质使用，因此，有关α-低聚半乳糖和α-半乳糖苷酶的功能及新的应用正在引起科技工作者的重视。

（四）大豆低聚糖的生产

大豆低聚糖是大豆中所含寡糖类化合物的总称，主要成分为水苏糖（Stachyose）、棉籽糖（Saffinose）及蔗糖。水苏糖是在蔗糖分子的葡萄糖基上以 α-1，6糖苷键连接2个半乳糖分子，而棉籽糖则以α-1，6糖苷键连接1个半乳糖分子。大豆低聚糖是目前所有新型低聚糖中唯一从植物中提取的新型低聚糖。水苏糖、棉籽糖广泛分布于植物中，特别是以豆科类植物中含量最多。

（五）帕拉金糖（Palatinose）的生产

1.帕拉金糖的构成及酶法合成

帕拉金糖（α-D-吡喃葡萄糖苷-1，6-呋喃果糖）是蔗糖的一种异构体。最初，在德国的一个甜菜糖厂的糖汁中分离出一株红色精朊杆菌（Protaminobacter rubrum），它可将蔗糖合成帕拉金糖。后来研究可采用酶法合成这种糖。发现能合成帕拉金糖的酶为 α-葡萄糖基转移酶（α-glucosyltransferase），这种酶可将蔗糖分子与果糖以 α-1，2-键结合的葡萄糖切离后，再以α-1，6-键的形式结合到原来的果糖分子上合成帕拉金糖。

2.α-葡萄糖转移酶及其产酶菌种

20世纪50年代中期发现帕拉金糖，70年代后期研究发现帕拉金糖具有很强的抗龋齿作用。后来陆续发现了多种具有强的合成帕拉金糖能力的微生物菌株。目前，能生产合成帕拉金糖的α-葡萄糖基转移酶的菌株主要有：红色精朊杆菌（Protaminobacter rubrum CBS57477）、沙雷菌属（Serratia plymuthica NCIB8285）、欧文菌属（Erwiniarhapontici）、克莱伯菌属（Klebsiella planticola）、拉内拉菌属（Lanelu）等。

克莱伯菌属经研究表明，它不仅是性能优良的α-葡萄糖基转移酶生产菌和帕拉金糖合成酶生产菌，如K.oxytocos-61（1989，日新制糖），K.terrigena CMl68（1989，名糖产业），K.SPNO88（1989，名糖产业），K.planticola MX-Ⅰ（1989，三井制糖），K.planticola MX-Ⅱ（1989，三井制糖），而且研究表明，克莱伯菌属微生物能高效地将蔗糖转化为帕拉金糖，而且不产或少产副产物葡萄糖和果糖，可以得到无色的反应液，可简化纯化工艺，有利于降低成本，防止微生物的污染。

3.帕拉金糖的酶法生产

帕拉金糖最早由日本三井制糖公司在1984年首先实现工业化生产，产品有60%以上的糖浆、99%以上的晶体或粉末。目前，已有包括我国在内的多个国家实现了工业化生产，总产量在1万t以上。其工业生产方法有如下几种：

（1）发酵法生产帕拉金糖 此法为在含有蔗糖（为主要碳源）并添加有菌种所需的氮源及其他无机盐的培养基中，培养出含α-葡萄糖苷酶的菌体，然后将菌体分离后混入已配制好的蔗糖溶液中进行蔗糖转化为帕拉金糖，转化完毕后分离菌体，经过滤、脱色、除盐、浓缩后得到糖浆，或经结晶处理后得到结晶或粉状的帕拉金糖。

（2）固定化菌体生产帕拉金糖 红色精朊杆菌和克莱伯菌所产的α-葡萄糖基转移酶，都是被蔗糖诱导产生的胞内酶，因而在应用其制造帕拉金糖时，最适于采用直接将菌体固定化的方法。其操作步骤如下：

①α-葡萄糖基转移酶菌体的发酵生产：首先根据所选用菌种的特性确定种子培养基和发酵产酶培养基，采用液体通风发酵的方法培养出高酶活力的α-葡萄糖基转移酶的菌体，然后离心分离出菌体。

②固定化菌体的制备：通常采用包埋和交联的方法配制，制得高强度的固定化菌体。将湿的菌体和4%的海藻酸钠溶液以1∶1在真空下混合均匀，压力喷入0.25mol/L的CaCl₂溶液中，钙化1～2h，水洗得到珠状的固定化细胞。将固定化细胞和等量的2%的聚乙烯亚胺（PEI）溶液混合，放置5min，立即过滤，回收吸附了PEI的固定化细胞，投入到5℃、0.5%戊二醛溶液中，缓慢搅拌30min，过滤，充分水洗，得到高强度的固定化菌体。

③蔗糖酶法转化合成帕拉金糖：把固定化菌体填充到柱式生物反应器中，将50%左右的蔗糖溶液调整到该固定化菌体中。α-葡萄糖苷酶的最适pH和温度，根据酶活力设计控制好蔗糖溶液的流速，酶法保温合成帕拉金糖。红色精朊杆菌和克莱伯菌属反应液及糖浆的糖分组成对比如表11-18所示。

表11-18 反应液和糖浆的糖分组成对比 单位：%（质量分数）

注：*日本现行帕拉金糖标准。

④帕拉金糖的回收精制：流出的酶反应液经过滤、活性炭脱色、离子交换脱盐、浓缩结晶，可以得到99%以上的帕拉金糖晶体，回收率可达到50%左右。回收结晶以后的糖浆，进一步精制后得到以葡萄糖-β-1，1-果糖为主要成分的液状产品帕拉金糖浆。