固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降。固定化酶在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收反复利用。使用载体结合法制成的固定化酶的Km有时发生变化，主要是由于载体与底物间的静电相互作用。从两者比较还可以看出，固定化酶pH曲线比较平缓，也就是固定化酶受缓冲液的影响较小，载体对酶起保护作用。......
2023-11-22
食品酶学：固定化酶及产业化应用研究成果
【摘要】：从理论上而言，酶的催化底物及产物均为液态，酶的固定化及其反应成为可能。酶的固定化还取决于固定化载体的选择及酶经固定化后其稳定性要好，酶的半衰期要长。因此，酶的固定化及其产业化应用研究属于应用基础研究，也属于酶工程研究前沿领域。如果将该酶固定化便可重复利用，降低生产成本。采用菌种选育和酶的修饰固定化能改善这一状况。
鉴于游离酶在工业生产应用时存在的弱点，把游离酶固定化便可重复利用并使催化过程连续化，可大大缩短酶促反应的周期，提高其生产效率。例如，在美国以玉米淀粉为原料经 α-淀粉酶液化和糖化酶糖化而得到的葡萄糖溶液再采用固定化葡萄糖异构酶或其固定化菌体则可连续地控制转化为果糖而制备成高果糖浆，这是一个很成功的将固定化酶应用于食品生产的实例。从理论上而言，酶的催化底物及产物均为液态，酶的固定化及其反应成为可能。酶的固定化还取决于固定化载体的选择及酶经固定化后其稳定性要好，酶的半衰期要长。因此，酶的固定化及其产业化应用研究属于应用基础研究，也属于酶工程研究前沿领域。
α-葡萄糖苷酶主要应用于异麦芽低聚糖的生产。商品化的异麦芽低聚糖的主要成分为异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖以及四糖以上分支低聚糖，此类低聚糖具有预防龋齿和促进双歧杆菌增殖等作用。日本市场上销售的产品型号多达10多种，产量超过2万t。目前，异麦芽低聚糖的生产以淀粉为原料，经α-淀粉酶水解为麦芽糊精后，再由真菌β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶共同作用而成为异麦芽低聚糖。因此，α-葡萄糖苷酶作为异麦芽低聚糖生产的关键酶制剂大有发展前途。但其价格昂贵，在一定程度上阻碍了异麦芽低聚糖的市场推广。如果将该酶固定化便可重复利用，降低生产成本。
2001年彭志英、岳振锋等对α-葡萄糖苷酶（ITGL）进行的固定化研究采用微形壳聚糖为固定化载体，以吸附-交联方法使α-葡萄糖苷酶固定化。研究结果表明 α-葡萄糖苷酶的操作半衰期可达到24d，以麦芽糖为底物时，α-葡萄糖苷酶的反应动力学参数无明显变化。
根据酶促反应动力学米氏方程，平行取5mg固定化酶和50U游离酶，以麦芽糖为底物，在0.0008～0.02mol/L浓度范围内，分别测定其在40℃、pH5.0条件下反应5min所生成葡萄糖的量，计算反应初速度，并以反应初速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/[S]）作图，结果如图10-1所示。
图10-1 ITGL的Lineweaver-burk作图
由图10-1求得游离酶的米氏常数Km为2.30×10-2mol/L，最大反应初速度Vmax为7.73×10-2mol/（L· min）；固定化酶的表观米氏常数Km为1.38×10-2mol/L，表观最大反应初速度Vmax为2.40×10-2mol/（L·min）。可见，固定化酶的表观米氏常数Km，略小于游离Km值。这是由于壳聚载体对麦芽糖有亲和吸附作用，使载体周围微环境内底物浓度高于整个反应体系的平均底物浓度。(www.chuimin.cn)
低聚半乳糖也是功能低聚糖的一种，它是一种重要的双歧杆菌增殖因子，有益于健康，同时具有降血脂、软化血管等作用。
低聚半乳糖是以乳糖为原料，经β-半乳糖苷酶转移半乳糖而得到的由葡萄糖和半乳糖组成的杂低聚糖。β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）在动植物和微生物体中分布广泛，但实际应用时一般以黑曲霉（A.niger）、米曲霉（A.oryzae）、乳酸克鲁维酵母（K.lactis）等作为酶源。美国FDA在1996年已认定拟热带假丝酵母（Candida pseudotropicalis）的β-半乳糖苷酶是安全的。目前，工业上生产低聚糖一般采用米曲霉和黑曲霉中β-半乳糖苷酶。它们存在的主要问题是：①产酶菌株的转移糖苷活力不高；②转移酶稳定性较差。采用菌种选育和酶的修饰固定化能改善这一状况。但从长远角度看，可通过基因手段来解决这一问题。即将控制β-半乳糖苷酶蛋白合成的有关基因克隆至其他系统中再扩大发酵培养，如将编码Lactococcus lactis subsp.Lactis ATCC7962β-半乳糖苷酶的基因克隆至大肠杆菌（E.coli）中并表达，转化子在含X-gal的LB培养基上呈蓝色，其β-半乳糖苷酶活力比原L.lactis要提高30%。分析表明，活性部位中有Glu429和Try475。因为酶耐热则不易失活，并在较高温度能减少其他微生物的生长机会，对固定化酶提高酶活力和使用率很重要。
随着膜技术在酶固定化中的反应，用各种膜将酶分子与生成的反应产物分开，制成了各种固定化酶生物反应器。与常规固定化方法相比，其初始反应速率提高1～3个数量级，扩散阻力低，传质效率高，短暂的反应时间即能达到相当的乳糖转化率。Miguel用多微孔PVC膜将米曲霉的乳糖酶固定，使乳清超滤浓缩液连续流过反应器，当乳糖转化率为25%～40%时，即5～15s的反应停留时间，可得到最高的低聚糖得率。
刘晨光、陈微等以戊二醛交联和壳聚糖为载体固定化脲酶的研究，结果认为选择凝胶状的壳聚糖为载体其固定化聚酶效果较好，为脲酶固定化提供了依据。
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2023-11-22
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2023-11-22
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2023-11-22
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2023-11-22
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2023-11-22
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