食品酶学导论：基因修饰技术的应用

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：图9-1 定点突变过程示意图（二）盒式突变技术盒式突变又称片段取代法，这是1985年由Wells提出的一种基因修饰技术，它可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些重要氨基酸进行“饱和性”分析，大大缩短了“误试”分析的时间，加快了蛋白质工程的研究速度。

在蛋白质工程出现以前，人们改造蛋白质分子的手段有诱发突变、蛋白质化学修饰等。诱发突变随机性大，是否能获得预期性的突变体，只有等待自然界的恩赐。蛋白质化学修饰在一定程度上可按照我们的意愿对分子局部实施手术，但由于化学修饰反应的不专一性以及由此而带来相应的副反应就很难对修饰结果作出结论性判断。同时，对分子内部一些疏水侧链氨基酸生物学作用的研究有局限性。在基因工程取得巨大成就的今天，由于限制性内切酶、DNA聚合酶、末端转移酶、DNA连接酶等工具酶以及各种载体的运用和发现，完全有可能克隆自然界所发现的任何一种已知蛋白质基因，并且通过发酵或细胞培养可生产足够量的这种蛋白质。因此，人们设想通过对编码蛋白质基因的定位突变和定向进化技术，人为地形成蛋白质突变体，为蛋白质工程修饰酶分子奠定了基础。

（一）定位突变技术

氨基酸是由一个三联密码所决定，其中第一或第二碱基决定了氨基酸的性质。因此，只需改变第一或第二碱基，就可以改变蛋白质分子中一种氨基酸残基为另一种氨基酸残基所取代，称作定位突变（Site-directed mutagenesis）。定位突变需借助噬菌体M₁₃的帮助，M₁₃的生长周期有两个阶段，当处于细胞外发酵液中时，质粒中的基因组以单链DNA形式存在。当侵入寄主细胞后，单链DNA基因组复制时以双链复制型存在。利用它生活周期的这一特点，可制备单链DNA模板分子，经过改造后的M₁₃分子含多个限制性内切酶位点，可用来插入所要研究的基因。位点需要一段寡聚核苷酸，其碱基顺序与模板分子中插入的基因顺序互补，但在欲改变的一个或几个碱基位点用别的非互补的碱基代替，这样因碱基不互补不能配对，所以当引物与模板形成杂交分子（退火）时，它们与相应碱基不能形成氢键，称为错配对碱基，在适当条件下，含错配对碱基引物分子与模板杂交，在DNA聚合酶I大片段作用下从引物的3′端沿模板合成相应互补链，在T₄连接酶作用下形成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子进入细胞后将分开并各自复制自己的互补分子。因此，可得到含两种噬菌体的噬菌斑，一种由原来链复制产生，称为野生型。另一种由错配碱基链产生，称为突变型。应用DNA顺序测定方法或生物学方法筛选，可以从大量野生型背景中找到突变体，从而分离出突变型基因，经转入表达系统可得突变型蛋白质。图9-1所示为酪氨酸tRNA合成酶Cys-35定点突变示意图，其基本程序是：①先将其基因克隆于PBR322，它可以在E.coli中高效表达然后再克隆到M₁₃mp₉₃上；②合成引物5′-CAAACCCGCT GTAGAG-3′，pBR₃₂₂这个引物只有与Cys-35密码子TGC中的T不能配对外，其余均能与模板互补；③借助Klenow酶和连接酶作用使引物延伸合成闭合环，通过蔗糖密度梯度离心分出共价闭环DNA，转入E.coli让M₁₃扩增；④从E.coli培养物中分出噬菌体，点到硝酸纤维滤纸上，并用5′-32P标记的引物进行印迹杂交，同时通过升高温度选择性地将标记引物从野生型基因上洗下，筛选出突变株。

图9-1 定点突变过程示意图

（二）盒式突变技术

盒式突变（Cassette mutagenesis）又称片段取代法（Fragment replacement），这是1985年由Wells提出的一种基因修饰技术，它可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些重要氨基酸进行“饱和性”分析，大大缩短了“误试”分析的时间，加快了蛋白质工程的研究速度。

加酶洗涤剂中使用的蛋白酶主要是枯草杆菌蛋白酶，由于它易遭氧化失活，因此洗涤剂中添加的漂白剂大大降低了该酶的酶效。氧化失活可以归因于活性Ser邻近第222位甲硫氨酸的氧化，尽管这个酶的空间结构已被测定，但我们无法从分子模型预示何种氨基酸替换甲硫氨酸能维持酶的活性并同时改善对氧化的稳定性。为此Wells提出盒式突变方法，其要点是：首先应用定位突变技术，在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原质粒和基因上没有新的限制性内切酶位点，然后将改造过的基因用于新位点的限制性内切酶消化，并随后将5种双链的25聚寡核苷酸在连接酶的作用下插入切口，每种双链寡聚核苷酸包含有一个三联密码的改变，形成5种不同质粒，经筛选并转入蛋白质水解酶缺陷型枯草杆菌突变株BG2036。从发酵液中可分离得到不同突变的枯草杆菌蛋白酶。从4组25聚寡核苷酸混合物分别可以得到在222位甲硫氨酸为19种氨基酸替换的枯草杆菌蛋白酶突变体。结果表明，突变酶对合成底物的活力除C-222突变体比原酶有所提高（138%）外，其余突变酶活力都有不同程度的下降，这些都很难从模型上预测。重要的是Ala-222、Ser-222、Leu-222突变体保留有50%酶活力，并可在1mol/L过氧化氢存在下1h不丧失酶活力，因此现在有可能生产出加酶漂白洗涤剂。

（三）蛋白质工程修饰酶分子

迄今人们已发现并鉴定了数千种酶，但真正有商业价值的不多，这是因为酶的生产成本高，同时由于自然界来源的酶的性质尚存在不稳定性问题，半衰期短，在实际应用上有其一定的局限性。20世纪80年代美国Genex公司K.ulmer第一次提出蛋白质工程概念，并建立了专门研究实体，制订了相应研究的开发计划。蛋白质工程程序如图9-2所示。

图9-2 蛋白质工程程序

溶菌酶是一个广泛应用于食品、医药工业的酶，由于其催化速率随温度升高而升高，因此，如何解决酶的热稳定性是一个关键性问题。T₄溶菌酶的晶体结构研究表明，其分子含一条肽链，并折叠形成两个在空间上相对独立的单元（结构域）。活性部位位于两个结构域之间，该分子含97位和54位两个未形成二硫键的半胱氨酸。二硫键是稳定蛋白质分子的空间结构重要的化学键，能将分子牢固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最通常的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。Perry基于对空间结构模型的仔细分析，选择通过突变溶菌酶第三位Ile为Cys来构建一对二硫键，结果与预想的一样，67℃时突变酶的半衰期由原来的11min提高到6h。如果同时用碘乙酸封闭余下的第54位的Cys或将其突变为Thr或Val，则同时提高了酶的抗氧化活力，新引入的“二硫键”稳定了两个结构域之间的相对位置，从而稳定了由两个结构域所形成的活性部位。引入二硫键时必须避免由于二硫键的引入带来的分子构象的改变所产生的失活效应。

改变工业用酶的最适pH是蛋白质工程的另一重要目标，葡萄糖异构酶是一个很好的例子。以淀粉为原料，经淀粉酶和糖化酶的作用生成葡萄糖浆，再以葡萄糖异构酶作用生成高果糖浆，这是一种新型的食品饮料甜味剂。糖化酶的反应pH为酸性，但葡萄糖异构酶的最适作用pH为碱性。虽然一些细菌来源的葡萄糖异构酶在80℃稳定，但在碱性pH下80℃将使糖浆“焦化”并产生有害物质，因此反应仅能在60℃下进行。如果能将酶作用的最适pH改在酸性，则不仅可使反应在高温下进行，也会避免反复调节pH过程中所产生的盐离子，从而省去最后离子交换一步，其经济效益显而易见。

（四）体外定向进化技术

近几年，出现所谓酶的体外定向进化技术（Direction evolution in vitro），它是模拟自然进化过程，在体外进行基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件下，定向选择获得具有优良特性酶的突变体的技术过程。例如，1993年K.Q.Chen等通过容错PCR技术进行定向进化，促使枯草杆菌蛋白酶在非水相催化活性提高157倍；2000年L.Z.Wang等用容错PCR技术进行定向进化，使天冬氨酸酶的K_m值降低到46%，酶活力提高28倍。(www.chuimin.cn)

1.DNA体外定向进化过程

蛋白质的定向进化技术开始于随机DNA片段库的建立与基因多样性文库的产生，然后通过高通量筛选选择，鉴别蛋白质的特性发生改善的基因，并将上述基因再诱变、筛选、积累有益的突变。通过DNA定向进化，可大大加快不同品种或不同基因型之间的重组进化速度，DNA体外进化的过程主要包括：

（1）通过随机突变或基因重组创造基因多样性，建立突变文库；

（2）突变体在适当生物体内建立表达与分析蛋白库；

（3）高通量筛选检出由一个氨基酸置换而引起的预期性状改善，精确选取阳性结果，供进一步进化；

（4）此过程的不断循环直至获得预期性状的新型蛋白质。

目前，已发展的定向进化常见的有容错PCR（Error-prone PCR）、交错延伸（Stagger extension process）和体外随机定位突变（Random site directed mutagenesis in vitro）等技术。

2.容错PCR（Error-prone PCR）技术

容错PCR是指在利用Taq酶进行目的基因的PCR扩增的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变的一种DNA体外进化技术。容错PCR是通过控制适当的反应条件，改变二阶段离子浓度和pH，使Taq聚合酶在基因扩增过程中，以可控制的比率使碱基发生错掺。例如，以每代每序列有2～3个碱基置换或一个氨基酸替代。一般而言，较高的错掺率将产生中性突变或有害突变。存在于许多突变体当中的有益突变可以用重组PCR的方法将它们组合，通过重组可以去除中性突变和有害突变。其他PCR改组方法包括：交错延伸（Stagger extension process，SEP）是在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链。经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度，结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。

3.体外定向进化技术在酶制剂改造中的应用

提高酶的催化活性和稳定性是人们对酶蛋白进行改造的两个最基本愿望。例如，L-天冬氨酸酶是一个重要的工业用酶，主要用于合成L-天冬氨酸。然而由于该酶不太稳定，在工业条件下活性不高，实际应用受到限制。Wang等通过定向进化的方法来改良L-天冬氨酸酶，经过四轮容错PCR和三轮DNA重组，得到L-天冬氨酸酶优化突变体，其活性提高了28倍，热稳定性也相应得到提高。此外，工业酶制剂在应用于化工工业中时，必须适应人为创造的恶劣环境，即使在高浓度的有机溶剂中也要保持较高的活性。有人利用随机突变和重组的方法，筛选得到三株磷脂酶A1突变体，该突变可以在有机溶剂存在的条件下有效发挥作用。还有人利用定向进化重组的方法（容错PCR和交错延伸法），大大增加了嗜冷枯草杆菌蛋白酶S41的热稳定性和催化活性，其中最佳的S41，突变在61℃时半衰期比野生型高出500倍。

运用定向进化的方法还可以提高酶的对映体选择性。比较成功的例子是Arnold等运用容错PCR和饱和诱变的方法，成功使一株倾向于D-型底物的乙内酰脲酶发生转变，使之变得倾向于L-型底物，大大增加了L-甲硫氨酸的产量，降低了不必要的产物积累。研究发现，突变酶与野生型酶相比只有一个氨基酸的替换。

食品酶学导论：基因修饰技术的应用

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