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2023-11-22
亲和标记修饰方法及其在食品酶学中的应用
【摘要】：亲和标记是一种特殊的化学修饰方法。这类试剂称为导向活性部位的抑制剂，又称亲和标记试剂。亲和标记试剂有两种形式：Ks型和Kc a t型。它的专一性，仅取决于它与酶结合的亲和力。对酵母的α-葡萄糖苷酶、果糖苷酶，对兔小肠蔗糖酶和异麦芽糖酶能够共价抑制，属于Kc a t型抑制剂。
亲和标记是一种特殊的化学修饰方法。早期人们利用底物或过渡态类似物作为竞争性抑制剂来探索酶的活性部位结构。如果某一试剂使酶失活，那么可以推断能与该试剂反应的氨基酸是酶活力所必需的。利用此技术对研究酶的活性部位结构已经取得许多有价值的结果。但是一般的化学修饰技术最突出的局限性是专一性不高，它们与酶分子反应时，不仅能作用于活性部位的必需基团，而且也能作用于活性部位以外的同类基团，这种局限性虽然可以通过底物保护的方法进行差示标记（differential labeling），但操作较繁杂。因此，为了提高修饰反应的专一性，将上述两种方法结合起来，在底物类似物上结合化学反应基团，使它们与酶有较高的亲和力而引入酶的活性部位，因而抑制剂在活性部位的浓度远高于活性部位以外的区域，从而与酶共价结合使酶失活。这类试剂称为导向活性部位的抑制剂，又称亲和标记试剂。例如，胰凝乳蛋白酶的共价抑制剂对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）就是这类抑制剂。
亲和标记试剂有两种形式：Ks型和Kc a t型。Ks型抑制剂是底物类似物上结合有化学活性基团。它的专一性，仅取决于它与酶结合的亲和力。Kc a t型抑制剂的专一性不仅取决于抑制剂与酶结合的亲和力，而且取决于它作为酶底物的有效性。这种底物具有潜在的化学反应基团，当它被酶作用后转变成有高度化学反应性能的基团，从而与酶的活性部位共价结合，因此这类化合物又称为“自杀底物”（suicide substrate）。
用E和Si分别代表酶和自杀底物，I为Si被催化后的抑制物，反应式表示如下：
式中，Ks为ESi的解离常数，Kcat为ESi转化为EI的催化常数，Ki是E和I形成共价结合的速度常数。抑制剂作用的有效性和专一性不但与Ks有关，同时还取决于Kc a t。因为Si单独与E结合还不能形成抑制剂，只有生成产物I以后才有抑制作用。Kc a t越大，生成产物的速度越快，抑制作用越强。Kc a t比Ks有更高的专一性，因为它需要酶的催化才能形成酶的抑制剂。因此，即使几种酶的底物有相同的空间结构，都能与Si结合，但不同的酶催化底物的反应性能不同。只有能使ESi生成I的酶才受Si的抑制。而且生成I的场所就在活性部位。“I”能够集中地“攻击”活性部位必需基团，因此Kc a t型抑制剂是专一性极高的试剂，已广泛地应用于探索酶的活性部位结构和研究酶的作用机制，在医疗上也有极大的应用价值。
一个不可逆抑制剂是否引入酶的活性部位，可以利用下列几点来判断：(www.chuimin.cn)
（1）与抑制剂作用后，酶完全失活，酶和抑制剂的反应以化学计量进行，即1mol抑制剂与1mol酶作用引起100%的失活。
（2）酶活力的丧失程度依赖于反应时间，与抑制剂的浓度有化学计量关系，抑制反应动力学表现为一级反应。
（3）真正的底物或竞争性抑制剂能阻止抑制作用。
这类抑制剂有3，5/4，6-环己烯四醇B环氧合物、3，5/4，6-四羟基环氧乙烷等。肌醇（inositol）具有葡萄糖吡喃环相似的结构，引入一个化学活性基团——环氧基团到肌醇分子中，得到它的衍生物——3，5/4，6-环己烯四醇B环氧合物（conduritol B epoxide）。该化合物对糖苷酶有很高的亲和力，分子内潜在的化学活性基团——环氧环在酶的催化作用下，发生类似底物质子化的变化而受到活化，变成对酶有高度反应活性的基团，能专一地不可逆地作用于不同来源的β-葡萄糖苷酶，包括曲霉属、酵母、苦杏仁、蜗牛和哺乳动物等。对酵母的α-葡萄糖苷酶、果糖苷酶，对兔小肠蔗糖酶和异麦芽糖酶能够共价抑制，属于Kc a t型抑制剂。
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