固定化细胞的应用及优势

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：而后者经载体在温和条件下固定化后，整个细胞仍保留细胞增殖活性和系列酶的活性，称为固定化活细胞。采用包埋法较为优越，在温和条件下，制成固定化活细胞已应用于工业化生产。如Jiang等将聚乙烯醇凝胶固定的鲍曼不动杆菌BS8Y用于苯酚的生物降解，结果表明固定化细胞比游离细胞具有更好的性能。固定化活细胞又称增殖性固定化细胞。细胞经固定化后，在培养基中仍可使细胞生长繁殖。

在固定化酶的研究基础上，为了缩短生产流程，降低成本，从20世纪70年代初起开展了固定化细胞（死细胞）和固定化活细胞的研究。前者经过固定化载体固定化后，虽然整个细胞活性消失，但是，需要利用的“目的酶”仍保持催化活性。而后者经载体在温和条件下固定化后，整个细胞仍保留细胞增殖活性和系列酶的活性，称为固定化活细胞。这种固定化技术为酶催化作用的连续化和科学化建立了基础，这是酶工程领域研究的最新进展。

固定化细胞技术，是利用物理或化学手段将具有一定生理功能的生物细胞（微生物细胞、植物细胞或动物细胞等）限制在一定的空间区域，利用其作为可重复使用的生物催化剂进行生物转化的一门技术。

微生物表面带有一定的静电荷，在一定条件下可以和载体的离子交换基团构成络合物制成固定化细胞。

例如，7.8g载体CM-纤维素悬浮于0.05mol/L pH5.8的磷酸缓冲液中平衡后，直接加入3000个米曲霉孢子于悬浮液中。用此悬浮液装柱（16mm×15mm）并用200～300mL缓冲液冲洗，即制得具有蔗糖酶活力的固定化活细胞。吸附法简单，载体可再生，但载体结合力较弱，细胞易脱落。采用包埋法较为优越，在温和条件下，制成固定化活细胞已应用于工业化生产。

细胞固定化技术的关键在于所采用的固定化载体材料的性能，理想的固定化细胞载体应具有以下特点：

（1）对微生物无毒，传质性能良好，具有高细胞容量；

（2）性质稳定，强度高、寿命长，材料价廉易得，操作容易的特点。

按材料的化学结构固定化细胞载体可分为有机高分子载体、无机载体及复合载体三种。

①有机高分子载体：分为天然高分子材料和合成高分子材料两大类。天然高分子凝胶载体包括琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙等，这些材料一般无毒，有较好的传质性，但机械强度不高，易被微生物分解。几种常见有机载体的性能比较，列举在表8-2中。合成高分子凝胶载体包括聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶等。聚乙烯醇是一种新型包埋载体，它机械强度高、化学稳定性好、抗微生物生物分解性能强、对微生物无毒且价格低廉。如Jiang等将聚乙烯醇凝胶固定的鲍曼不动杆菌BS8Y用于苯酚的生物降解，结果表明固定化细胞比游离细胞具有更好的性能。

表8-2 几种常见有机载体材料的性能比较

②无机载体：多具有多孔结构，通过物理吸附作用和点和效应进行细胞的固定，包括硅藻土、活性炭、陶珠和氧化铝等。具有机械强度大、无毒、不易降解的优点，但与细胞的结合不牢固，易发生细胞脱落现象。

③复合载体：是有机材料和无机材料相结合而成的固定化载体。它有效利用了两种材料的优点，将各种材料的缺点尽可能弥补，制备的固定化细胞在机械强度、稳定性等方面的性能有较大的提高。

固定化活细胞更接近于天然细胞酶系统的催化作用，但从其反应机理来看比固定化酶更复杂：

（1）固定化对酶产生的某些影响对细胞同样表现出增加其稳定性，其稳定性还可因两价离子存在和因抗菌素存在而增加；

（2）细胞内环境的相对恒定和细胞的缓冲作用，固定化对胞内酶产生的影响不像固定化酶那样明显；

（3）固定化细胞除了受固定化因素影响外，还受细胞结构及细胞膜透性影响，如果经一定条件保温或表面活性剂处理，其酶活力相应增加；

（4）固定化细胞还要考虑菌体生长、生理生化及它们在颗粒内的分布等问题。

固定化活细胞又称增殖性固定化细胞。细胞经固定化后，在培养基中仍可使细胞生长繁殖。例如，采用琼脂包埋的酵母菌，在培养基中培养2d，其酵母细胞数由10⁶个/cm³增殖至10⁹～10¹⁰个/cm³。

细胞经固定化后酶不会受外界环境影响，在细胞中比较稳定，特别对于需要辅酶的酶类再生辅酶或其他辅助因子就显得更为容易。(www.chuimin.cn)

固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和，其制备方法主要有物理吸附法、包埋法、共价法和交联法。

（一）物理吸附法

物理吸附法是利用载体和细胞表面所带电荷的静电引力，使细胞吸附于载体上。载体对微生物的吸附主要是细胞表面与载体表面间的范德华力和离子型氢键的静电相互作用的结果，两者间的γ电位与细胞壁组成和带电性质，载体性质一同影响吸附作用的强弱。吸附法条件温和，操作简单，对细胞活性影响小，但操作稳定性不高。

例如，酿酒酵母在pH4条件下带负电，选择带正电陶瓷作为载体，通过其间的静电作用，可把70%以上酵母牢固地吸附住。

又如利用α-甘露聚糖和伴刀豆球蛋白A的专一亲和力，也可将酿酒酵母连接到伴刀豆球蛋白A上而达到固定化的目的。因为酿酒酵母的细胞壁含有α-甘露聚糖。

（二）包埋法

包埋法是将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法。根据载体材料和方法的不同，分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。包埋法条件温和，细胞容量高但成本低，是细胞固定化最常用的方法。一般采用的载体为琼脂、海藻酸钙、角叉莱聚糖、明胶、壳聚糖等。

（1）琼脂包埋法配置一定浓度琼脂，加热熔化，冷却至50℃时与细胞悬浮液混匀，在四氯乙烯溶液中形成珠状或冷却后切成块状。

（2）海藻酸钙包埋法在室温条件下配制一定浓度的海藻酸钠，与细胞悬浮液混匀，然后滴加到氯化钙溶液中形成珠状。一般10g凝胶可以包埋200g细胞（干重）。

（3）κ-角叉莱聚糖包埋法配制一定浓度 κ-角叉莱聚糖，加热溶化后，冷却至35℃，与细胞混匀，然后滴加带氯化钾溶液或其他二价或三价金属离子溶液变成凝胶。可制成珠状、膜状或切成块。为了提高其颗粒强度，用戊二醛进行交联。

（4）明胶包埋法配制成10%明胶，加热溶化后，冷却至32℃，与细胞混匀，然后制成一定形状，用戊二醛交联，以提高其稳定性。

（5）壳聚糖包埋法粉末状或片状壳聚糖先用醋酸或盐酸溶解，再用注射器滴入凝结液制成球状颗粒，蒸馏水洗至中性，丙酮洗涂脱水，50℃真空干燥制成微球形多孔壳聚糖载体，然后与细胞混匀并用戊二醛交联，制成固定化活细胞。

（三）交联法

交联法是利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团反应达到固定细胞的作用。该法可提高单位体积中的细胞浓度，但由于细胞机械强度低，无法再生，且试剂毒性强，使其应用受到限制，实际中常与其他方法联合使用。

（四）共价法

共价法是利用细胞表面的反应基团与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。该固定法稳定性高，但由于其反应激烈，条件难控，试剂毒性强，一般只能用于死细胞的固定化上。

固定化活细胞在食品、化工生产中已得到有效应用。20世纪70年代末，法国研究成功固定化细胞生产啤酒；80年代初我国居乃琥等用固定化细胞批量生产啤酒和酒精。目前批量应用于生产啤酒、酒精、氨基酸、有机酸、酶制剂、果葡糖等。其中用于固定化微生物细胞生产葡萄糖异构酶，在制造高果糖浆发挥着巨大作用。例如，美国Miles公司采用海藻酸钠为载体，并用戊二醛交联的木立黄杆菌（Flavobacterium arborescers）细胞生产固定化葡萄糖异构酶“Takasweet”，其生产能力比游离葡萄糖异构酶提高2～3倍，丹麦Novozyme公司采用固定化鼠灰链霉菌（S.murinus）突变株制成固定化异构酶“SweetzymeT”，生产能力比游离酶提高3～5倍，其固定化酶的技术已发展到第三代的水平。

我国学者王思新采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），以海藻酸钠为载体固定化，在培养液中增殖，应用于苹果鲜榨汁及浓缩汁为原料的果酒发酵，其研究结果，固定化活细胞半衰期达到48d，可批量生产周期比分批发酵生产周期缩短一半。我国水果资源极为丰富，该研究成果为传统果酒发酵生产的革新提供科学依据。

固定化细胞的应用及优势

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