食品酶学导论：固定化酶的催化机理

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：从反应工程方面分析，固定化酶反应系统属非均一催化反应。反应产物又从固定化酶活性部位扩散到主体溶液。因此，存在扩散限制，固定化酶不可能得到大环境相同水平的产物。酶固定化后，因载体电荷性质的影响造成酶催化的微环境的变化。一般来说，当反应产物为酸性时由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使得区域pH降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的最适pH。

从反应工程方面分析，固定化酶反应系统属非均一催化反应。通常，底物溶于连续相水溶液中，固定化酶悬浮于其中。如图8-12所示，以单底物反应为例（S→P），底物S从反应液主体传递到酶固体颗粒外表面，然后扩散到酶分子上，而生成物P则刚好与此途径相反。由于只有反应液主体中底物和生成物的浓度是可以分析的。这样建立起来反应速度称为表观反应速度。要弄清底物和产物在固液界面附近和粒子内的传递关系，才能掌握反应机理。

图8-12 底物和产物的传递过程

底物（S）和酶（E）用海藻酸钠凝胶包埋制作的固定化酶在反应前的分布，模拟如图8-13所示。对液体酶反应，当酶浓度为10^-2mol/L时，酶与底物间最大平均距离为20nm，对于固定化酶反应，若固定化酶颗粒直径为0.1mm（100μm）时，则距离固定化酶粒子最近的底物与颗粒中心酶的距离为20μm，为液体酶的1000倍。因此，固定化酶反应的物质传递对反应速度的影响变得更重要了。

图8-13 游离酶与固定化酶反应体系对比

游离酶经固定化后所引起的酶性质改变，归纳起来有下列几种原因：

（1）酶分子构象的改变和载体的屏蔽效应前一种影响是酶分子在固定化过程中发生了某种扭曲，使酶分子拉长，改变酶活性部位的三维结构，从而改变酶的活性，如图8-14所示。这种效应被称为构象效应，一般出现在吸附法和有共价键参与的固定化中；后一种是指酶在固定化以后，酶的活性部位受到载体的空间障碍，使酶分子活性基团不易与底物接触，从而改变酶活力。这两种原因都直接导致了酶与底物结合能力或酶催化转化能力的改变，从而影响酶活力。

图8-14 固定化引起的构象改变和屏蔽效应示意图

（1）酶活中心构象未改变，可以结合底物（2）酶活中心结合底物（3）载体形成屏蔽效应（4）固定化引起的构象效应

（2）微环境效应微环境是指固定化酶附近的环境区域，而主体溶液则称为大环境，反应系统中由于载体和底物的疏水性、亲水性以及静电作用引起微环境和大环境之间不同的性质，这样就形成了分配效应，如图8-15所示。分配效应使得底物或其他各种效应物在微环境与大环境之间的不均匀分布，从而影响酶反应速度，实验测定的是大环境浓度，而反应本质行为是微环境中浓度。用超声波处理，可促使微环境中的浓度梯度大大降低，从而加速反应速度，提高固定化酶活力。

图8-15 固定化酶的微环境与宏观环境(www.chuimin.cn)

（3）扩散阻力固定化酶的反应系统和液体酶不同，即底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部活性部位。反应产物又从固定化酶活性部位扩散到主体溶液。因此，存在扩散限制，固定化酶不可能得到大环境相同水平的产物。这在扩散速率很低，而酶活力又很高时特别明显。扩散限制效应可分为外扩散效应和内扩散效应。外扩散是发生在固定化酶表面周围的能斯特层（Nernst层），其底物从大环境主体溶液中向固定化酶表面传递使得底物在固定化酶周围形成浓度梯度，随着搅拌速度增加而减少；内扩散发生在多孔固定化酶载体的内部，是底物或其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间运转过程中的扩散限制。由于微环境内的化学效应，造成底物的消耗和产物的积累，形成浓度的不均匀性，从而影响固定化酶的一系列性质。

游离酶是在溶液中进行，E和S是以随机方式自由运动，其反应式为：

ES形成速度是被扩散所限制的，K₁是大的，一般K₁=10⁶～10⁹L/mol·s，而固定化酶不在溶液中进行，而是在固液界面上进行，底物必须达到界面上才能转变成产物。假定载体是不溶于水的，载体被Nernst层或扩散层所包围。由于存在一个穿过扩散层的浓度差（梯度）。因此，在邻近不带电的载体部位，其底物浓度低于在溶液整体部位底物的浓度。因而，固定化酶具有较低的酶活力和较高的表观K_m值。而降低表观K_m值方法很多，主要有：①减小酶载体的体积，降低扩散厚度；②提高搅拌器搅拌速度或流动速度；③以静电效应减少或消除Nernst层。

这三种效应的产生都是由于酶和固定化载体发生了相互作用，如图8-16所示。因此，主要取决于固定化条件和方法，但部分也取决于载体的性质。这三种效应通常总是相互关联地存在的，它们综合在一起决定着固定化酶的动力学性质，其中构象改变是直接影响酶的因素；分配效应和扩散限制则是通过底物或效应物在微环境和大环境的不等分布来影响固定化酶反应的。

图8-16 不同酶反应速率之间的关系

酶固定化反应系统与游离酶不同，其反应方式、动力学特性等均有差异，可分为以下三种模式（图8-17）并进行比较。

图8-17 固定化酶反应系统三种模式比较

（4）pH的影响pH会影响动力学参数。酶固定化后，因载体电荷性质的影响造成酶催化的微环境的变化。一般当载体带负电荷时，其最适pH较游离酶偏高，这是由于多聚阴离子载体会吸引溶液中的阳离子使其附着于载体表面，结果使固定化酶扩展层氢离子浓度比周围的外部溶液高，即偏酸，因此外部溶液中的pH必须向碱性方向偏移，才能抵消微环境作用。反之载体带正电荷时其最适pH向酸性一侧偏移。此外，如果考虑到扩散限制效应，情况则更为复杂。若酶反应产生或消耗氢离子，对固定化酶的最适pH也有明显影响。一般来说，当反应产物为酸性时由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使得区域pH降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的最适pH。为此固定化酶的pH要比游离酶高一些。反之，产物为碱性时，固定化酶的最适pH要比游离酶低一些。

食品酶学导论：固定化酶的催化机理

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