《食品酶学导论》-酶的纯化方法

抽提的酶液是否需要进一步经过纯化，要视其应用的要求。一般工业的酶，如纺织工业应用α-淀粉酶脱胶处理，往往采用液体粗酶便可；皮革工业应用的细菌蛋白酶也是如此。食品工业应用的酶如果粗酶液已达到食品级标准要求，特别是卫生指标，也无需进一步纯化。然而，应用于医药、化学试剂级的酶液必须进一步纯化。因为粗酶液常含有多种同类或异类的物质，如含有其他蛋白质（杂蛋白）或其他酶（非目的酶）、核酸、多糖、脂类和少量小分子物质。因此，酶的纯化目的是把粗抽提酶液采用科学纯化方法制备成纯度高的酶制品。

酶的纯化方法很多，现根据酶的溶解度、分子大小、电离性质、稳定性和亲和力等方面性质，其方法分述如下。

酶属两性电解质。在中性盐的低浓度下的溶解度随着盐浓度升高而增加，称为盐溶作用。但在高浓度中性盐溶液中其溶解度则随着盐的增加而下降，并使蛋白质析出，这种作用称为盐析作用。这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团存在着静电引力，当溶液中加入盐类时，盐类的离子与水分子对蛋白质极性基团静电引力作用，使蛋白质溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时，水分活度降低，蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子周围存在的水化膜被破坏，使蛋白质分子间聚集而沉淀析出。

在盐析时，蛋白质的溶解度与溶液中的离子强度关系，可用式（7-5）表示：

式中 S——蛋白质的溶解度，lgS为溶解度的对数；

β——离子强度I为零时溶解度的对数，β=lgS₀；

S₀——蛋白质在纯水（I=0）中的溶解度；

KS₀——直线斜率，为盐析常数，它与蛋白质结构和性质有关；

I——离子强度，可按式（7-6）计算：

式中 C——各种离子的物质的浓度；

Z——各种离子的价数。

根据式（7-5），纯化酶（或蛋白质）可以在一定的pH及温度下改变盐的离子强度，称为K_s分段盐析法。因为蛋白质在其等电点时溶解度最低，而在一定pH条件下，蛋白质在中性盐溶液中的溶解度随着温度的升高而下降。

盐析剂常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中硫酸铵应用较多，其优点为温度系数小、溶解度大、分段盐析效果好和不易引起酶变性失活。其缺点为提纯效率不高，硫酸钠的溶解度在30℃时太低。磷酸钠的盐析效果好，也因溶解度低受限制，采用硫酸铵作为盐析剂有许多优点，但由于硫酸铵不纯，不能应用于食品级酶制剂的生产。

盐析剂用量的决定，往往采用实验来确定，因为其用量随不同酶而异，还随其共存杂质种类和数量而有不同。

实验步骤：

①取25mL容量瓶多个；②分别加入计算量粉末（NH₄）₂SO₄；③20℃发酵液分别定量至25mL，使（NH₄）₂SO₄浓度分别为0、10%、20%和30%等；④在20℃恒温2h，用滤纸过滤；⑤各取滤液10mL，分别测定其中残存酶活力。

如图7-6所示，目的α-淀粉酶与杂质酶（如蛋白酶），其两者盐析曲线非常接近，用分步盐析法很难有效地把它们分开。而与其他杂质蛋白则可按盐析曲线差异，可分步盐析分离。

分段盐析曲线如图7-7所示。

图7-6 枯草杆菌α-淀粉酶发酵液的盐析曲线

图7-7 分段盐析曲线

w₁浓度可除去大部分杂蛋白，此时目的酶很少沉淀析出，沉淀物分离后再加一定量盐析剂w₂，此时，目的酶已基本沉淀析出，而杂蛋白很少混进目的酶中。

实际应用盐析剂时由于加入固体硫酸铵，容易引起局部盐浓度过高。因此，要求达到饱和度不太高时，可采用添加硫酸铵溶液，其加入量可按式（7-7）计算：

式中 V——应添加饱和硫酸铵溶液体积；

V₀——开始溶液体积；

S₂——需要达到的饱和度；

S₁——开始溶液的硫酸铵饱和度。

盐析法的最大优点作用比较温和，不易引起酶变性失活，其缺点为沉淀物含有大量盐析剂，而且制品含有硫酸铵恶臭气味，如不经脱盐便不符合食品级酶的要求。其脱盐可以采用透析法，也可采用葡聚糖凝胶柱（Sephadex G25或G50）来进行，故在生产上制造食品级酶多采用有机溶剂法。

由于有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子表面不同电荷引力，导致溶解度降低；同时有机溶剂的亲水性大，能破坏蛋白质水化膜，故可利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离沉淀酶（或蛋白质），称为有机溶剂分离沉淀法。

有机溶剂沉淀蛋白质的能力随蛋白质种类及有机溶剂的种类而不同。一般有机溶剂的沉淀能力依次为丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇。这个顺序还受温度、pH、盐离子浓度等因素影响。丙酮分离效果最好，变性失活情况也较小，除了丙酮外，乙醇等也常用。在食品级酶制剂生产中采用乙醇较多，特别是生产食品级酶制剂对卫生要求有保证。

有机溶剂的用量常采用相当于酶液二倍体积的有机溶剂沉淀酶蛋白，在分段沉淀时，有机溶剂的最适浓度也应通过实验来确定。如果采用逐步提高有机溶剂浓度，它的用量可按式（7-8）计算：

式中V和V₀——分别为加入的有机溶剂体积和原溶液的体积；

S、S₁和S₂——分别为待加的有机溶剂、原来溶液中含有的有机溶剂和溶液要达到的有机溶剂质量分数。

有机溶剂法的优点是分辨率高，溶剂易除去，适于食品级和医药级酶提纯。缺点是有机溶剂会破坏蛋白质的氢键，易引起变性失活，所以特别要注意搅拌均匀，尽可能减少其变性失活。

由于有机溶剂在酶液中溶解性能较差，而且易变性失活，20世纪70年代初发展起来的液-液双水相技术在一定程度上解决了这个问题，而且解决了因粒子小造成堵塞滤网等问题，能有效地使酶与核酸、多糖等可溶性杂质分离。

该技术的基本原理是根据一种或一种以上亲水性聚合物水溶液的不相溶性，任何两相含有较高的水分，亲水聚合物对多数酶有稳定作用，细胞碎片、多糖、酯类、核酸及酶的性质不同，在两相中分配系数不同，因而达到分离目的。

分配系数

式中 K——分配系数；

C_T——上相酶浓度（活力）；

C_B——下相酶浓度（活力）。

K是由聚合物浓度、pH、离子强度、温度及被分离物质的量来决定的。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种水溶性聚合物，当其浓度为0.2g/mL时，黏度仍比较小，这种特性不易使蛋白质变性，而能对蛋白质起保护作用。它在溶液中形成网状物，与溶液中蛋白质分子发生空间排阻作用，从而导致蛋白质分子从其所占位置上沉淀下来。

水溶性聚合物的辅助物质右旋糖酐（dextran）和磷酸钾，构成液-液双水相的两个分离系统。

例如，从兔肌液相中分离提纯α-磷酸甘油脱氢酶工艺为：

第一次水溶性聚合物抽提系统：聚乙二醇-右旋糖酐；

第二次水溶性聚合物抽提系统：聚乙二醇-磷酸钾；

将酶原液转入第二次磷酸钾富相后，可通过超滤、离子交换层析等方法使酶与聚乙二醇分开。

这种分离技术发展很快，开始时仅用于粗提取液的处理，现已成为酶的提纯技术之一，经过几次连续的液-液双水相处理，使产品获得相当高的纯度。如由保依地尼假丝酵母菌（Candida boidinii）发酵产生的甲酸脱氢酶经四次连续抽提获得总收率为70%，纯度为≥70%的产品，如图7-8所示。

图7-8 液-液双水相法由Candida boidinii发酵液中分离提纯甲酸脱氢酶

1-发酵罐发酵酶液2-喷嘴式分离器收集菌体 3-玻璃珠破碎细胞 4-热变性 5-第一次液-液双水相抽提去除细胞碎片等物质 6-喷嘴式分离器收集两相 7-第二次液-液双水相抽提去除核酸、多糖及某些蛋白质 8-第三次液-液双水相抽提为进一步提纯甲酸脱氢酶 9-第四次液-液双水相抽提为甲酸脱氢酶转入上相 10-酶产品，在4℃可稳定几个月 ▽-液面M-马达

诸多因素可影响分配系数K，但最终酶在双水相中的分配情况是各种因素的综合结果，根据Albertsson的方程式：

lnK=lnK_el+lnK_hphop+lnK_hphi+lnK_conf+lnK_lig

式中 el——双水相系统中可能存在的电荷；

hphop——疏水；

hphi——亲水；

conf——构型；

lig——配基作用。

在液-液双水相中所含的多聚物的类型及含量对多种酶的分配系数的影响是不同的，其提纯酶收率可高达80%～90%，提纯倍数也较高。此技术应用于生物活性物质的提纯很有发展潜力。

1959年，Porath和Flodin首先提出和应用凝胶渗透色谱法，现已广泛应用于酶、多糖、核酸、蛋白质及其他生物活性大分子的分离和纯化工作。

凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC），又称分子筛层析法。其原理主要是利用具有网状结构凝胶分子筛的作用，根据被分离物分子大小不同而分离。待分离系统中小分子物质直径比凝胶孔径小，可渗入凝胶微孔中，产生阻滞作用大、流程长、移动速度慢，最后流出。而大分子由于阻滞作用小，流程短，移动速度快，先流出。

分子被凝胶颗粒阻滞的程度，取决于该分子在固定相和流动相中的分配系数K_d，因此，为了衡量样品中组分流出顺序，通常采用分配系数K_d来量度。

式中 V_e——洗脱液体积；

V_o——凝胶间空隙体积；

V_i——颗粒内部微孔体积；

K_d——分配系数，也就是溶质分子大小的一个函数。

当K_d=1，即V_e=V_o+V_i，说明该组分可进入微孔而最后流出。当K_d=0～1，K_d值小的先流出，大的后流出。V_e、V_o、V_i可以通过实验测定。(www.chuimin.cn)

对于凝胶有一定要求，一般要求凝胶具有惰性，与溶质分子不发生任何作用；离子基团含量低，孔径大小要均一，选择范围要宽和机械强度要高等。

该法应用的凝胶主要有如下几种。

1.交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

这种凝胶是以葡聚糖凝胶为原料，交联剂为环氧氯丙烷，在碱性条件下制成三维空间网状结构Sephadex，目前市售Sephadex G10至G200共有8种，如表7-4所示。G表示凝胶保水值，单位为mg/g干胶，G10即为该凝胶保水值100mg/g干胶的10倍。G200为凝胶保水值的200倍，保水值越大，交联度越小，结构松弛，易吸水。该种凝胶具有稳定性好，水中溶胀快，pH 3～10可应用。

表7-4 各种葡聚糖凝胶

续表

2.交联琼脂糖凝胶（Sepharose）

该凝胶是以琼脂为原料经过精制、交联而成交联琼脂糖凝胶（Sepharose），瑞典Pharmacia Fine Chemicals商品名为Sepharose CL-2B、CL-4B、CL-6B等产品，其优点为多孔，流体流动性好，分离稳定性好和适于高温110～120℃灭菌操作。

该凝胶制造过程中，先除去琼脂胶等物质后得到琼脂糖。其分子结构是以D-半乳糖和3，6-脱水半乳糖相间排列组成的链状多糖胶，再通过分子间的缔合而成的网状物质。孔径大小由凝胶浓度决定。以商品名Sepharose为例，有2B、4B和6B等规格，分别表示琼脂糖含量为2%、4%和6%。这类凝胶由于其孔径较大，适合应用于分子质量较大的生理活性物质如病毒、细胞颗粒体和DNA等物质的分离。琼脂糖凝胶除上述三种外，尚有Bio-GeI A-和Sepharose CL两种交联凝胶。前者为琼脂糖与丙烯酰胺交联而成，有较密集孔径，适用有氢键分解试剂存在时蛋白质的分离；后者是在强碱条件下和3，3-二溴丙醇反应而成的物质，适用于有机溶剂和氢键分解试剂存在时蛋白质分离。这类凝胶的特性如表7-5所示。

表7-5 有关琼脂糖凝胶的性质

凝胶过滤层析法主要应用于酶液的浓缩、脱盐和分级分离。前两种应用小孔径凝胶便可达到目的，如应用Sephadex G-25可把分子质量5000u以下的蛋白质分离浓缩，同时又有较好的机械强度和流动特性。而分级分离，一般选用低排阻极限的凝胶为宜，因为可提高其流速和回收率。

柱层析操作过程包括：层析介质的平衡、膨润；装柱；加样；扩展以及流出液成分的检测和分部收集。

凝胶层析的效果通常以洗脱曲线表示，以流出液中的蛋白质浓度（如A₂₈₀）或酶活力相对洗脱（液）体积（V_e）的图形表示，如图7-9所示，其分离效果的标准为分辨率高，回收率高，稀释度小和速度快。其中分辨率可用R_s权衡，R_s=两峰之间距离/峰宽，当R_s=1.2时，通常认为已达到分离效果。

图7-9 凝胶过滤层析洗脱曲线

1-Po 2-Ald 3-BSA 4-OVA 5-CTogen 6-RNas A

凝胶层析条件：凝胶为Sephadex G-200，超细型；层析柱为Pharmcia K26/70；洗脱液：0.05mol/L磷酸缓冲液，内含0.1mol/L NaCl；流速：1mL/（cm²·h）。

凝胶过滤层析法除应用于分离浓缩、纯化等工艺外，同时还应用于测定酶及蛋白质的分子质量及去除热原物质。前者用一系列已知分子质量的标准样品放入同一凝胶层析柱内，令其在同一条件下进行凝胶层析分离，记录每一种成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子质量的对数作图，在一定分子质量范围内可得到一直线，作为标准曲线。然后，待测定的样品在同样条件下通过层析，测得洗脱体积便可与标准曲线对照测得其分子质量。所谓热原物质是指微生物产生的能使人发热的物质，如某些多糖蛋白质复合物等。由于DEAE-A25型葡聚糖凝胶对热原物质有较强的吸附能力，因此，用这种凝胶处理无离子水，可以得到适于制备注射剂应用的无热原水。

3.聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶是以丙烯酰胺与交联剂N，N′-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的网状高分子物质。以商品名Bio-Gel P-为例，P-后的数字乘以1000，表示该种凝胶可应用于分离蛋白质的最高分子质量。表7-6所示为各种Bio-Gel P-的特性数据。

表7-6 各种聚丙烯酰胺胶

续表

聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（Ap）的作用下聚合而成的高分子网状聚合物。反应过程尚需加入有效加速剂N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）。

凝胶的孔径大小与单体浓度、交联剂有关。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以用式（7-11）计算：

式中 r——凝胶平均孔径；

C——丙烯酰胺单体浓度；

k——常数，一般k=1.5；

d——分子直径（一般不卷曲分子直径为0.5nm）。

经过实践证明，丙烯酰胺浓度为7.5%时，r为2.73nm，5%时r为3.35nm，因此，如果酶分子直径大于上述两个数字，则可采用这种凝胶进行纯化酶的工作。

聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性、透明、有较好的热稳定性和化学稳定性，是一种非离子型凝胶，故在酶和蛋白质纯化中得到广泛应用。同时，上述凝胶层析法还应用于去除热原物质和制造无离子水，应用于脱盐、高分子溶液的浓缩等。

超滤技术是20世纪70年代发展起来的膜分离技术，它在提纯酶过程中已得到广泛应用。其基本原理是利用有选择性透过的微孔膜，在液压作用下，分离提纯大溶质分子（如蛋白质、酶、核酸、多糖等），其作用原理如图7-10所示。

图7-10 超滤技术提纯大分子物质示意图

根据滤膜孔径和操作压强的差异，超滤与微滤、电渗析、反渗透等膜分离技术有别，其应用范围也是不同的，如表7-7所示。

表7-7 各种膜分离技术的特点

超滤技术传质过程、装置型式及应用等内容前一章节已经叙述。

亲和层析是近几年发展起来的并有效地应用于分离纯化生物活性大分子的一种新技术。其基本原理是利用生物分子间酶与辅酶、酶与底物、抗原与抗体、激素与受体等均具有较高专一亲和力，而且能可逆专一地形成酶-配基的络合物。因此，将这类配基（Ligand）偶联固定于待分离纯化系统溶液中，便可从中把目的物质“抓”出来。亲和层析示意图如图7-11所示。

1967年，Axen等采用BrCN活性载体的方法，把配基固定于载体中，然后与待分离纯化系统偶联起来，取得了显著效果，也推动了固定化技术发展。

亲和层析技术应用的载体要求具有亲水性、结构疏松、惰性和具有大量可以和配基偶联反应的基团。根据这些要求，目前应用最多的载体为琼脂糖，因为琼脂糖无论在亲水性、结构疏松、反应性能、机械强度等均较理想，并经得起0.1mol/L酸碱、7mol/L脲等较长时间处理。在酶的分离中琼脂糖4B更为优越，它的偶联基团为羟基，结构疏松，能使分子质量为10⁶u的大分子物质自由通过。

图7-11 亲和层析技术示意图

配基的选择也是十分重要的。理想的配基应具备如下条件：

（1）配基与酶要有较强的亲和力，因为吸附和洗脱都由这种力来决定。若要纯化某种酶，则要加入对此酶要有专一亲和力的物质。如底物类似物、抑制剂、辅助因子、效应剂、辅酶等。其作用力的强度可以用解离常数K_diss和亲和常数K_ass表示为：

优良的配基其选择范围为：10^-4mol/L＞K_diss＞10^-8mol/L（或者10⁴mol/L＜K_ass＜10³mol/L），若K_diss过小（K_ass过高）则酶与配基之间作用力过强，解吸困难；反之，K_diss过大其两者之间结合力过弱，又很难提高吸附效果。

（2）配基本身应具有供偶联固定用的活泼基团，同时，与载体结合后，不应影响或破坏配基与酶间的相互作用。

（3）配基应具有一定的偶联量，其配基偶联量过高或过低均不适宜。前者可造成洗脱困难，也会造成空间障碍和非专一性吸附，后者分离效果也不佳。一般，配基偶联量1～20μmol/mL膨润胶较为合适。

对于分离纯化效果而言，亲和专一性越强，分离纯化效果越佳，对每一种具体物质的纯化就需要很好设计和制备一种相应的配基吸附剂，常采用的一些具有“族”专一性的配基如表7-8所示。

表7-8 某些常用的“族”专一性配基

续表

偶联是亲和层析技术中的关键一步，载体和配基都有相应的偶联基团，但最常采用的是先将载体偶联基团活化，其中葡聚糖和琼脂糖的羟基可用溴化氰作用形成活泼的亚氨基碳酸盐衍生物；聚丙烯酰胺的酰胺基或用水合肼处理形成酰肼衍生物，或者在此基础上再经亚硝酸处理，形成叠氮的衍生物。其反应式为：

活化处理后，其伯胺基或芳香基可直接与亚氨碳酸基或叠氮基反应，便完成配基与固相载体的偶联。

这种直接偶联制得的亲和吸附剂，由于与酶活性部位距离太远，尚需在配基与载体间加上一段短“手臂”，便可消除空间障碍，改善其亲和吸附能力。

“手臂”（spacer arms）的特点是：①具有和载体及配基进行偶联的功能基团；②不带电荷，具有亲水性物质；③化学处理而不改变其特性。可应用作为“手臂”的物质有三类：①碳氢链化合物（如α，ω-二胺化合物、α，ω-氨基羧酸）；②聚氨基酸（如聚DL-丙氨酸、聚DL-赖氨酸等）；③某些天然的蛋白质（如白蛋白等）。第一类最为常用，其氨基能直接和亚氨基碳酸盐或酰肼反应。其反应式如图7-12所示。

图7-12 加“手臂”反应

吸附和洗脱是亲和层析技术中保证其纯化得率的关键一步。首先要确定适宜的吸附条件、pH、离子强度、温度和某些金属离子的存在与否，同时测定其配基的含量、亲和吸附剂和样品量的最适比例。因为样品的体积与亲和结合力有关。蛋白质浓度也不要超过20～30mg/mL，流速也不宜大于10mL/（cm²·h）。

洗脱的方法有多种，一般可分为两类：非专一性洗脱与专一性洗脱（表7-9）。

表7-9 常用亲和层析的几种洗脱方法

续表

底物类似物竞争性洗脱其中亲和专一性洗脱主要用于“族”专一性吸附剂或结合力相当低（如K_diss：10^-6～10^-4）的情况。例如，以游离NADH从5′-AMP-Sepharose 4B上洗脱激酶或脱氢酶。洗脱方式或者通过升高亲和洗脱剂的浓度梯度进行，或者用几种相应不同的解吸剂进行脉冲洗脱。

举例：磷酸纤维素纯化依赖RNA聚合酶。RNA聚合酶是一种酸性蛋白酶，在pH8时，它结合到阴离子交换剂如DEAE-葡聚糖凝胶和DEAE-纤维素上。然而，在同样的pH条件下，也能结合到阳离子交换剂磷酸纤维素上，这是因为磷酸纤维素上的磷酸基团具有模板RNA上磷酸基团同样的功能特异性亲和力，而且含量远比DNA上的磷酸基团多。因此，用磷酸纤维素来纯化聚合A、B、C并把它们分别纯化是十分有效的。

根据Gissinger等方法处理磷酸纤维素，装柱后用含0.05mol/L（NH₄）₂SO₄的缓冲液（0.02mol/L Tris-HCl pH8，0.01mol/Lβ-巯基乙醇，0.01mol/L EDTA-Na，1mol/L苯甲基磺酰氟和10%的甘油）平衡。将RNA聚合酶A和C的混合液中（NH₄）₂SO₄浓度调至0.05mol/L后上柱，然后用起始缓冲液作梯度洗脱，分部收集，第一个活力峰为聚合酶C，第二个活力峰为聚合酶A。以15μg加样量，在4%、5%和6%聚丙烯酰胺电泳，酶A和酶C均为一条区带。RNA聚合酶除用DNA-纤维素和琼脂糖凝胶、磷酸纤维素亲和层析外，还可用肝素-琼脂糖凝胶作为配基分离纯化。由此可知，对于某一欲纯化的酶或蛋白质，可用不同配基进行亲和层析纯化，例如溶菌酶的纯化，其配基则采用细菌细胞壁水解物，载体为琼脂糖凝胶Sephadex 4B制成吸附剂分离纯化溶菌酶。其处理过程如图7-13所示。

图7-13 溶菌酶的纯化

经过测定，该法每克凝胶可偶联68mg配基，酶活力可回收80%。

又如，α-淀粉酶纯化可采用β-环状糊精为其配基，因为环状糊精为 α-淀粉酶的抑制剂。选择载体为琼脂糖凝胶，制成亲和吸附剂以纯化α-淀粉酶。其过程如图7-14所示。

图7-14 α-淀粉酶的纯化

含有辅酶的酶类的亲和层析技术首先将辅酶固定化，如氧化还原酶和脱氢酶。因此，用固定化的NAD可以分离不同类型的氧化还原酶和脱氢酶。4.1单位的甘油-3-磷酸脱氢酶、37单位的乳酸脱氢酶和0.9mg牛血清白蛋白混合物通过以二氨基己酸为“手臂”的固定化NAD柱（1.0cm×10cm、含有约17μmol辅酶，用0.15mol/L磷酸缓冲液，pH7.0平衡）。用平衡液洗涤亲和层析柱，可洗去不吸附的牛血清白蛋白，此级分不含有任何酶活力。而甘油-3-磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶分别被0.15mmol/L的NAD⁺和0.15mmol/L NADH所洗脱。