食品酶学导论：酶的抽提方法

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：酶是在活细胞中合成并在胞内或胞外介质中存在的。胞内酶在细胞内存在部位和结合状态比较复杂，因而抽提难度较大。酶的抽提目的是将尽可能多的酶或尽可能少的杂质从原料组织和细胞中引入溶液，以利于酶的纯化。但此法用于酶的大量提取有一定局限性。经丙酮处理的细胞干粉称为丙酮粉。丙酮还能除去细胞膜部分脂肪，更有利于酶的提取。根据酶在细胞内结合状态以及其溶解程度，酶的抽提可分为水溶法和有机溶剂法两种。

酶是在活细胞中合成并在胞内或胞外介质中存在的。胞内酶在细胞内存在部位和结合状态比较复杂，因而抽提难度较大。酶的抽提目的是将尽可能多的酶或尽可能少的杂质从原料组织和细胞中引入溶液，以利于酶的纯化。

一般对动物材料要先剔除结缔组织和脂肪组织，然后再捣碎；油料种子需要先脱脂处理（如用乙醚）和脱壳，避免单宁等物质的干扰。微生物材料在抽提前也需将菌体与发酵介质分离。材料应保持新鲜或添加抗氧化剂或立即冷冻处理，以防酶变性失活。例如，从番木瓜中割取胶乳，应立即添加抗氧化剂然后粗滤除杂，并进一步层析分离和真空冷冻干燥成干粉。

对于微生物材料而言，一般胞外酶不存在破碎细胞问题，而胞内酶只能在破碎细胞后才能释放出来，表层酶（透性酶）还要破坏与膜的连接问题，这一点，破碎细胞显得重要。

破碎细胞的方法主要有如下几种：

（一）机械破碎法

机械破碎法包括研磨法和细菌磨法。

1.研磨法

研磨法是将微生物细胞与磨料（玻璃砂、石英砂、氧化铝等）混合，在研钵中用杵研磨，细胞破碎后，用水或缓冲液抽提，抽提出来的溶液即为粗酶液。

实验举例：酵母异柠檬酸脱氢酶的制备

以新鲜面包酵母为材料，称取面包酵母10～15g，加入在冰浴中20mL 0.1mol/L NaHCO₃溶液及10～20g干净的玻璃砂，置于乳钵中研磨。酵母细胞壁比较坚硬，有时需要反复研磨，也可适当调节酵母与玻璃砂的比例。再于660g下离心10min，然后收集上清液。最后在高速离心机中1000g离心1h，此时得到的上清液即为含酶溶液。

此法简单，无需特殊设备，但产量低，难以大规模操作，需要在冰浴中或冰室中操作。如用干冰或液氮冷却后进行研磨，则不必加入磨料。

2.细菌研磨法

1957年中国科学院王大琛教授等设计的细菌磨，已推广应用于小型微生物细胞研磨，使用效果好，破碎率达到99.99%。其基本结构如图7-1所示，主要由研磨和动力两个部分构成。

图7-1 细菌磨结构示意图

细菌磨研磨部分包括：①长15cm，直径5cm硬质磨砂玻璃管作滚筒，滚筒内可以装碎冰，以保持低温操作。②一个与半面滚筒面滚筒密切贴合的凹面瓷质承座。玻璃管和穿过中心的钢轴以橡皮塞连接，滚筒与承座相互贴紧，承座底下垫以强有力的弹簧。动力为62.2W、1400r/min，经减速后滚筒为120～130r/min。

实验举例：多聚核苷酸磷酸化酶（PNP酶）的制备

（1）取冷冻菌体8g，融化后按1∶（1.3～1.5）加入玻璃砂调成糊状物。

（2）用不锈钢勺取5g左右自旋转滚筒前边加入，在细菌磨上研磨，研磨温度可维持15℃以下，研磨时间为20～30s。

（3）用玻璃板横置于滚筒上，刮下经过均匀研磨的混合物。

（4）悬浮于2.5倍体积的pH7.4，0.01mol/L Tris-HCl缓冲液（含0.01mol/L醋酸镁和0.001mol/L EDTA）中，约20mL。

（5）搅拌提取15min后，0℃离心（13400g）20min。

（6）轻轻倾出上清液，其沉淀物再用上述缓冲液4mL抽提一次，离心，合并上清液，即为粗提取酶液。

此法比研磨法省力，其破碎率也较研磨法效率高。

（二）物理方法

1.超声波破碎法

超声波破碎法的基本原理是利用超声波（10～15kHz）的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生时的空化作用（cavitation），液体形成局部减压，引起液体内部产生很大的压力，致使细胞破碎。

超声波破碎法操作简便，可连续或批式操作，由于在处理时会产生热量，必须在冰浴中进行，杆菌类细胞和动物性细胞的破碎，酶的回收率可达85%以上，但对霉菌、酵母、放线菌和球菌类细胞的破碎有一定的局限性。

2.渗透压法

利用渗透压的突变，造成细胞内外压力差而引起细胞破碎。细胞的周围介质浓度与细胞的稳定性紧密相关，如把细胞置于高渗溶液（如20g/L NaCl）中，使细胞脱水，最后引起细胞质壁分离。相反，把细胞置于低渗溶液（如0.1g/L NaCl）或水中，则水分子从溶液中进入细胞内引起细胞膨胀、破裂，从而使细胞内含物质释放出来。该法操作比较复杂，条件要求严格，仅适合于少量样品的处理。

3.冻融法

冻融法将细胞反复交替地冰冻与溶融，使胞内形成冰结晶及胞内外溶剂浓度突然改变，导致细胞破裂。(www.chuimin.cn)

（三）酶解法

利用外源的溶菌酶或破壁酶在一定条件下催化细胞壁破碎而促使酶从细胞内释放出来。酶解法破碎革兰阴性细菌细胞壁时，除加入溶菌酶外，尚需添加EDTA螫合剂，而处理革兰阳性菌时，则添加7.5%的聚乙二醇或0.2～0.6mol/L的蔗糖用作稳定剂。此法操作条件温和，内含物成分不易受破坏，细胞壁损坏程度也可以控制。因此，在提取细胞内其他成分或制备原生质球和细胞生理学研究等方面有实际应用。但此法用于酶的大量提取有一定局限性。

（四）表面活性剂处理法

表面活性剂处理法是利用表面活性剂改变细胞膜、壁的通透性，使酶或胞内其他内含物释放。通常采用表面活性剂包括十二烷基硫酸钠（SDS阴离子型）、二乙氨基十六烷基溴（阳离子型）、吐温（非离子型）、Triton×100（聚乙二醇烷基芳香醚）等。表面活性剂的添加，最后会增加酶提纯的压力，尚需采用离子交换树脂或分子筛把表面活性剂除去。

（五）丙酮粉法

丙酮粉法是利用丙酮能使细胞迅速脱水并破坏细胞壁的作用。细胞经离心收集菌体，在低温下加入冷却的丙酮液，迅速搅拌均匀后随即用布氏漏斗抽滤，再反复用冷丙酮液洗涤数次，抽干后置于干燥器中低温保存。经丙酮处理的细胞干粉称为丙酮粉。丙酮还能除去细胞膜部分脂肪，更有利于酶的提取。

细胞破碎方法有很多，但各自均有其特点，对于分离提纯某一目的酶，具体采用何种方法比较合适，则需靠分析、比较和判断来确定。

抽提（extraction）或提取（或萃取）其含义基本相同。抽提是指在酶的分离纯化前期，将经过处理或破坏的细胞置于一定溶液中，使被提取的目的酶与其他物质分离的过程，包括酶与细胞固体残渣的分离、酶与其他物质的分离。

根据酶在细胞内结合状态以及其溶解程度，酶的抽提可分为水溶法和有机溶剂法两种。

（一）水溶法

大部分酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，其中稀盐和缓冲溶液对酶稳定性好，溶解度大。采用水溶法时，需注意下列因素：

（1）盐浓度常采用等渗溶液即0.15mol/L NaCl和0.02～0.05mol/L磷酸缓冲溶液或碳酸缓冲溶液。含金属离子的酶，需避免其解离，尚需添加金属离子螫合剂（如EDTA等），并使用柠檬酸钠缓冲溶液或焦磷酸钠缓冲溶液。如果能溶解在水溶液中或者与细胞颗粒结合不太紧的酶，细胞破碎后选择适当稀盐溶液便可达到提取的目的。

（2）pH pH与酶的稳定性紧密相关。一般在提取操作时控制在偏离等电点（pI）两侧为宜，这样可增大酶或蛋白质的溶解度。例如，细胞色素C和溶菌酶属碱性蛋白质，在提取时常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，则在稀碱溶液中提取。此外，如果细胞中的酶与其他物质以离子键结合，则需控制pH3～6，对解离离子键有利。

（3）温度一般在低温（5℃以下）操作，以防止酶变性失活。但是有少数酶对温度耐受力较高，则可适当提高温度，使杂质蛋白在变性条件下分离，以利于下一步提纯。

（4）辅助因子在提取操作时，适当加入底物或辅酶成分，可改变酶分子表面电荷分布，提高其提取效果。一般，为了提高酶的稳定性，防止蛋白酶发生破坏性水解作用，往往加入苯甲基磺酰氟（PMSF），而防止其氧化，则加入半胱氨酸、惰性蛋白和底物等。

（二）有机溶剂法

有一些酶与脂质结合得比较牢固，不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，则采用不同比例的有机溶剂进行提取，如植物种子中的酶用70%～80%乙醇提取，动物细胞中的微粒体、线粒体存在的酶则常用正丁醇提取。因为正丁醇亲脂性强，可提高酶的溶解度。已有实验证明，用正丁醇提取碱性磷酸酯酶效果明显。

采用有机溶剂提取时，存在着物质在两个互不相溶的液相中浓度的分配定律起作用问题。分配定律的定义可表示为在恒温、恒压和比较稀的浓度下，某一溶质在两个不相混合的液相中的浓度分配比，它是一个常数，即为式（7-1）：

式中 C₁——分配达到平衡后溶质在上层有机相中的浓度；

C₂——分配达到平衡后溶质在下层水相中的浓度；

K——分配常数，不同溶质在不同溶剂中有不同的K值。

从式（7-1）可知，K值越大，则在上层有机相中溶解度越大。反之，K值越小，则在下层水相中溶解度越大。如果混合物中各组分K值彼此接近时，则需不断更换新的溶剂系统，通过多次抽提便可把各种物质分离。同时，采用有机溶剂法提取时尚需考虑溶剂的性质、pH、离子强度、介电常数和温度等因素的影响。

在提取过程中，酶从固相扩散至液相难易，是由以下扩散方程式决定的。

式中 G——扩散速率；

D——扩散系数；

A——扩散面积；

ΔC——两相间界面溶质的浓度差；

ΔX——溶质扩散的距离；

t——扩散时间。

从式（7-2）可知，两相界面溶质之浓度差，为扩散的主要推动力。ΔC越大，扩散越快。操作过程中采用搅拌也可使ΔC加大。此外，还与细胞破碎程度有关，细胞破碎可使扩散面积A增大，也可减少扩散距离ΔX。

食品酶学导论：酶的抽提方法

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