食品酶发酵法：一段导引

酶制剂的大规模工业生产始于第二次世界大战后，随着抗生素工业的发展，微生物的培养技术、发酵工艺和发酵设备的研究都有了长足进步。1949年，日本开始采用液体深层培养法生产细菌α-淀粉酶，标志着微生物酶的生产进入大规模工业化阶段。此后，蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等的生产也相继进入工业化规模。20世纪60年代，酶法生产葡萄糖获得成功，10年之后，已能够利用葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖生产高果糖浆，并相继发展了与食品工业关系密切的脂肪酶、凝乳酶、乳糖酶等酶制品。

酶制剂工业是新型的发酵工业，是生物工程的重要组成部分，各国都十分重视生物催化剂的发展，每年以7%～8%的速度增长，国际市场从1983年酶制剂销售额4亿美元，至1999年销售额达到19.2亿美元，2008年达到30亿美元，目前大约达到50亿美元。其中，全球食品酶制剂市场2013年产值达到13.47亿美元，2016年达到37.74亿美元。

目前，世界上发达国家的知名酶制剂工厂共约70多家，其中有25家规模较大，排名前7名为：①丹麦Novozyme；②美国Genencor；③荷兰Gist-Brocades；④芬兰Cultor；⑤比利时Solvay；⑥丹麦CHR Hansen；⑦法国Rhone ponlene。其中Novozyme公司是世界上最大的酶制剂生产厂，并在丹麦、日本、美国、巴西、中国等国设厂，每年投入科研开发经费高达1.5亿美元，占公司销售收入的12.5%，在发酵水平、产品品种开发和经济效益等方面均处于世界领先水平。

我国的酶制剂工业也有很大的发展，到目前为止，酶制剂厂有90家，其中无锡星达生物工程公司、山东沂水酶制剂厂、广东江门生物中心等几家产量较大，发酵工艺水平和装备水平较高。其他均属中小型酶制剂企业，与国际水平尚有较大差距（表6-7）。

表6-7 国内外发酵水平比较 单位：U/g

微生物种类繁多，包括细菌、放线菌、真菌等约有10多万种，酶的品种齐全。在不同环境条件下，微生物可以利用不同基质，有各种各样代谢类型。微生物生长速度要比农作物快500倍，比家畜快1000倍。微生物培养简单易行，生产规模可大可小。采用大型发酵罐培养技术可以大规模生产各种酶制剂，以生产1kg结晶蛋白酶为例，如从胰脏提取，需要用1万头牛的胰脏，而用微生物发酵生产，则只需要几百千克的淀粉、麸皮和黄豆粉等农副产品，在几天内便可生产出来。另外，微生物容易变异，特别是可以采用遗传工程、细胞工程技术进行菌种选育和代谢控制，不但可以提高酶的产量，还可提高原有酶种的活性。

作为食品级酶，其发酵生产具有一些特殊的要求，主要反映在安全与卫生两个方面。应用于食品工业的酶均以所谓酶制剂的形式使用。当酶制剂作为一种食品添加剂使用时，其中各种有关组分通过各种途径进入人体，所以对其卫生安全性作一个全面评价是必要的。食品酶制剂的毒性有的来自微生物本身，有的是在制造过程中混入的有害物质。

用发酵法生产的酶可能会含有某些生物毒素等物质，例如黄曲霉毒素。酶制剂还可能会受到沙门菌、化脓性葡萄球菌、大肠杆菌等病原性微生物污染，在生产过程中应当杜绝。微生物发酵生产的酶制剂，通常采用玉米粉、豆饼粉、米糠、麸皮等原料，如果这些原料发生霉变，也可能产生上述黄曲霉毒素之类的有害物质。在酶制剂生产中还要添加一定量无机盐类，如硫酸铵、磷酸二氢钠、氯化钠和硫酸钠等。这些无机盐带入汞、铅、铜、砷等重金属离子的可能性也不容忽视。

因此，生产食品级酶制剂，不仅菌种要严格控制，而且要选好原料，防止有害物质的污染，并选择合理的提取工艺。关于食品酶制剂的安全问题，联合国粮食及农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）的食品添加剂专家联合委员会（JECFA），在1977年做出如下规定：凡从动、植物可食部位的组织，或用食品传统加工过程使用菌种生产的酶制剂产品，可作为食品对待，无需进行毒理试验，只需建立有关酶化学和微生物学方面的说明；凡由非致病性的一般食品污染微生物生产的酶制剂，要进行毒性试验。在美国及欧洲大陆，对酶制剂生产菌种都有相应的限制，如美国政府批准使用的酶制剂生产菌种有黑曲霉、米曲霉、枯草杆菌以及橄榄色链霉菌等十种。

英国食品化学法典规定的食品酶制剂安全检测项目和限量要求如表6-8所示。

表6-8 食品酶制剂的安全检查项目

对于食品酶制剂的卫生要求主要包括：按照良好的生产食品方法制造，酶制剂中不应含有发酵液残渣；酶制剂作为食品添加剂带入细菌数目不应超过该食品所允许的限度；酶制剂在食品生产中不应带入危害人体健康的杂质。

酶的发酵生产根据细胞的培养方式不同，可分为固体培养发酵、液体深层发酵和固定化细胞发酵等。

固体培养发酵的培养基，以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的麦曲，经灭菌、冷却后，接入产酶菌株进行发酵。我国传统的各种酒曲、酱油曲等都采用这种方式生产。固体培养的优点是设备简单、操作方便、麦曲中酶浓度高、特别适用于霉菌培养。缺点是劳动强度较大，原料利用率较低，生产周期较长。

液体深层发酵是将液体培养基置于发酵容器中，经灭菌、冷却后加入产酶菌株，在一定条件下进行发酵。液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式，不仅适用于微生物细胞，也适用于植物、动物细胞及工程菌的发酵。液体深层发酵的机械化程度较高，而且易于科学管理，酶的生产效率较高，质量较好，收率较高。

固定化细胞是指固定在水不溶性载体上而能进行正常生命活动的细胞。固定化细胞发酵具有如下特点，细胞密度大，可加速生化反应，提高生产能力；细胞流失少，可以连续发酵；发酵过程稳定性好，易于操作控制，利于实现自动化生产；节省培养种子所需的设备和原材料；发酵液中含菌体少，利于产品的分离纯化，提高产品质量。但由于固定化细胞发酵是20世纪70年代后期才发展起来的新技术，历史不长，技术较复杂，需要特殊的固定化细胞反应器，而且只适用于胞外酶的生产等，因而还有不少问题有待研究解决。

酶的发酵生产是一个十分复杂的过程，因此，一个切实可行的技术路线，要结合菌种性能（如培养要求）、酶系特点、使用要求、生产成本等综合考虑。大规模工业生产时，对培养基的消毒灭菌、种子培养及接种量、发酵罐型式、工程管理等都要进行详细的研究，使产酶量增加，提高经济效益。此外，还要求工艺流程中各工序要合理，例如，发酵液中菌体要便于分离，培养液黏度要低，选择不产大量杂酶及杂质的培养基及一般不产色素或异臭的培养条件。

酶的发酵技术内容包括培养基设计、选择合适的发酵方式及发酵过程的各种参数控制等。

1.培养基

设计和配制培养基时，应考虑pH及营养成分的种类和比例是否满足产酶微生物生长及酶形成的需要；还需考虑到有些细胞生长繁殖和产酶阶段所要求的培养基有所不同，在此情况下，应分别配制生长培养基和发酵培养基。培养基的组分一般包括碳源、氮源、无机盐、生长素和金属离子等。

（1）碳源 培养基的碳源是指能够向微生物提供组成细胞物质或代谢产物（酶）中碳骨架的营养物质。碳源是微生物生命活动的能量来源，也是多种诱导酶的诱导物。

不同微生物要求的碳源是不同的，这由菌种自身的酶系决定。如葡萄糖氧化酶产生菌在以甜菜糖蜜作碳源时不产酶，但以蔗糖作碳源时酶产量却显著增加。又如产生葡萄糖异构酶的短乳杆菌，在以木糖为碳源培养时产酶，以葡萄糖为碳源时，尽管菌体繁殖旺盛，但不产酶。碳源的类型除对产酶量有影响外，还对微生物胞内酶与胞外酶的比例有影响。

可以作为微生物碳源的物质很多，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜及各种淀粉类农作物，如山芋粉、玉米粉、麸皮、米糠等。石油中的各种烷烃、甲烷等含碳氢元素的化合物及乙醇、乙酸等有机醇、酸类，也可作为碳源。

（2）氮源 氮素是组成微生物细胞蛋白（包括酶组分）和核酸的主要元素之一，通常将提供氮素来源的营养物质称为氮源。氮源可分为有机氮源和无机氮源两类。有机氮源包括各种蛋白质、蛋白胨、多肽和氨基酸以及天然原料如鱼粉、酵母膏、豆饼粉、花生饼粉等蛋白质物质；无机氮源包括含氮素的无机化合物，如硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾和氯化铵等。不同微生物对氮源的要求不同，应根据要求进行选择和配制。

此外，碳源和氮源两者的比例对酶的产量有显著影响。所谓碳氮比（C/N）一般是指培养基中碳元素（C）总量与氮元素（N）总量之比值，可通过碳源和氮源的含量计算而得，有时也可用碳源总量和氮源总量的比表示。

（3）无机盐类 无机盐是提供细胞生命活动所不可缺少的无机元素。各种无机元素的主要功用有所不同，有些是细胞的组成成分，如磷、硫等；有些是酶的组成成分或与酶的活性紧密相关，如磷、硫、镁、钾、铁及微量元素锌、铜、钴、钙、钼等；有些对培养基的pH、渗透压和氧化还原电位起调节作用，如钠、钾、钙、氯等。

根据细胞对无机元素的需要量大小，可分为主要元素（宏量元素）和微量元素两类。主要元素有磷、硫、镁、钾、钙、钠等，微量元素有铁、铜、锰、锌、钼、钴、碘等。微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但需要量极少，过量反而会引起毒害作用。

（4）生长因子 微生物还需要一类微量物质才能进行正常生长繁殖，这类物质统称为生长因子，包括维生素、嘌呤碱和嘧啶碱等。这些物质都是辅酶或辅基组分。酶制剂工业生产所需的生长因子，大多是由天然原料提供。例如，玉米浆、麦芽汁、酵母膏等，这些原料中生长因子的含量都很丰富，另外，豆饼、玉米、麸皮、米糠中也含有多种维生素等生长因子。

（5）产酶促进剂 产酶促进剂是指能显著增加酶产量的某种少量物质，它们一般是酶的诱导物或表面活性剂。酶的诱导物除酶作用的底物或底物类似物外，还包括能被该微生物转化为诱导物的前体物质。某些表面活性剂也能增加酶的产量，它们能提高细胞膜的渗透性，从而使细胞内的酶容易分泌出来，胞内酶不断产生，培养液中酶浓度逐渐积累增大，从而提高了酶产量。常用的产酶促进剂一般有吐温80（Tween 80）、洗净剂LS（脂肪酰胺磺酸钠）、聚乙烯醇、糖脂、乙二胺四乙酸（EDTA）等。

（6）阻遏物多数工业酶制剂如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等酶均属诱导酶，其生产过程受代谢末段产物阻遏和分解代谢阻遏的调节。如果培养液中存在葡萄糖之类的易于利用的碳源时，会抑制酶的合成。为了避免分解代谢阻遏，提高酶产量，可以利用多糖类或聚多糖类作为碳源，或采用分次添加碳源（或限量添加）的方法，控制细胞增殖速度，使培养液中碳源保持在不致引起分别代谢阻遏的浓度。例如，采用限制葡萄糖的连续流加法发酵时，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶产率提高60倍，液化产其单胞菌（Aeromonas liquefacieus）的果胶酶产率提高600倍。采用控制碳源流加速度的流加培养发酵时，使巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）边繁殖边消耗淀粉碳源，结果其产量比原单批培养发酵提高了3.6倍。以上所举例子都是避开代谢产物的抑制结果，实际上还可以采用菌种选育法或基因工程法获得不受抑制的菌株。

图6-16 液体深层发酵生产的一般工艺流程

2.微生物酶的生产流程

酶的种类繁多，产酶菌种各异，但其发酵生产的工艺流程是相似的，一般有固态发酵法和液体深层发酵法之分，具体采用何种方法由微生物和酶的种类来决定。微生物酶液体深层发酵工艺流程如图6-16所示。

3.发酵罐的构造

酶制剂发酵生产的关键设备为发酵罐。发酵罐的类型除传统型发酵罐外，还有自吸式、气升式、内外循环等。传统型通气搅拌发酵罐仍广泛应用于酶制剂、氨基酸和有机酸等的发酵生产，其典型构造如图6-17所示。

图6-17 小型传统典型搅拌式发酵罐(www.chuimin.cn)

1-皮料出口 2-底轴承 3-搅拌器 4-轴 5-温度计接口 6-螺旋片 7-皮套 8-冷却水出口9-取样口 10-视镜 11-轴封 12-轴承带 13-轴承支座 14-三角皮带传动15-电动机16-手孔17-接压力表 18-挡板 19-热电偶接口 20-通风管 21-冷却水进口 22-压力表接口23-进料口 24-取样口 25-进气口 26-补料口 27-手孔 28-视镜

图6-17为小型传统发酵罐的结构示意图（包括剖面图和俯视图），附有圆盘式涡轮搅拌器；在底部有单开口的通气管，沿罐的周壁装有垂直挡板，挡板与罐壁之间留有空隙，防止积存渣垢。

图6-18为大中型发酵罐的结构示意图（包括剖面图和俯视图），它与小型罐多采用排管换热器代替夹套进行冷却，因为罐的容积越大，则其单位体积培养液具有的周壁表面积越小，在大中型罐中排管换热器放在罐内，等圆周角分布。传统型通气搅拌发酵罐，适用于一般原料、牛顿型或非牛顿型流体，它在酶制剂工业和抗生素工业中较为通用。

图6-18 大中型传统典型搅拌式发酵罐

1-视镜 2-通气管 3-搅拌器 4-温度计插口 5-中轴承 6-联轴器 7-扶梯 8、20-人孔9-轴封 10-电动机 11-三角皮带传动12-轴承座 13-取样14-轴 15-冷却列管16-温度计17-冷却列管放水口 18-底箱体19-进料口 21-压力表 22-取样口23、24-排气孔 25-补料口 26-空气进口

4.液体深层发酵过程的控制

酶发酵生产中，菌种产酶性能是决定发酵效果的重要因素，为了提高产酶水平，需对发酵过程参数进行良好控制。这些过程参数除培养基组成成分外，还包括温度、pH、搅拌、消泡、溶解氧等，这些参数对微生物产酶的影响是相互联系、相互制约的，若给予良好的调节控制，可使酶的生物合成达到最佳状态。

（1）发酵过程中pH的变化与控制 培养基的pH与细胞的生长繁殖和产酶情况密切相关，不同种类的微生物，其最适生长pH不同。大多数细菌的最适pH6.5～7.5（中性或微碱性），霉菌和酵母菌的最适pH3～6，放线菌最适pH7～8（微碱性）。

产酶时最适pH通常接近酶反应的最适pH。例如，生产碱性蛋白酶的最适pH为碱性（pH8.5～9），生产中性蛋白酶的最适pH为中性至微酸性（pH6～7），生产酸性蛋白酶的最适pH为酸性（4～6）。但是，有些酶作用最适pH与细胞产酶最适pH有明显差别。

有些微生物能同时产生几种酶，通过控制培养基的pH，可以改变各种酶之间的产量比例。例如，黑曲霉可产α-淀粉酶和糖化酶，当培养基的pH偏中性时，α-淀粉酶增加而糖化酶减少；当pH偏酸性时，糖化酶产量增加而 α-淀粉酶减少。米曲霉生产蛋白酶时，当培养基的pH呈碱性时主要产碱性蛋白酶，降低pH，则主要产中性或酸性蛋白酶。

培养基的pH在细胞生长繁殖和新陈代谢过程中常会发生显著变化，这与细胞特性有关，但主要受培养基组分的影响。糖含量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使培养基的pH向酸性方向移动；培养基中蛋白质、氨基酸含量较高时，代谢会产生胺类物质，使pH向碱性方向移动；以（NH₄）₂SO₄为氮源时，随着氨被利用，培养基pH会下降；以尿素为氮源时，随着脲酶水解尿素生成氨，培养基pH会上升；若有磷酸盐存在，则会对培养基的pH起一定的缓冲作用。

因此，可以通过改变培养基的组分和比例来实现对pH的调节，必要时可加进酸、碱或缓冲溶液来调节。

（2）发酵温度与控制 温度是影响细胞生长和代谢活动的重要因素，严格保持菌种生长繁殖和生物合成所需的最适温度，对稳定发酵过程，缩短发酵周期，提高发酵单位和产量都具有很重要的现实意义。不同的微生物有不同最适生长温度，如枯草杆菌最适生长温度为34～37℃，黑曲霉最适生长温度为28～32℃等。

产酶最适温度往往低于生长最适温度，这是由于在较低的温度下，可延长产酶时间，提高酶的稳定性。例如，用米曲霉发酵生产蛋白酶，28℃比40℃条件下发酵的产量高2～4倍，20℃条件下发酵，蛋白酶产量最高。因而，酶的发酵生产有时可在不同的阶段控制不同的温度。在生长阶段控制在最适生长温度，以利于细胞生长繁殖；在产酶阶段，温度控制在酶最适温度。

在发酵过程中，细胞新陈代谢会不断放出热量，使培养基温度升高，而热量的不断扩散，又会使温度降低。因此，必须经常及时地加以调节，使发酵温度控制在适宜的范围内。

（3）发酵过程中泡沫形成与控制 发酵培养液中含有豆饼粉、蛋白胨、玉米浆等各种蛋白质，由于与通风和搅拌时所产生的小气泡混合，会在发酵过程中产生一定数量的泡沫。随着菌体的繁殖和发酵的正常进行，整个发酵过程中有时形成过多和稳定持久的泡沫，会导致发酵罐利用率降低。

发酵液中的泡沫是各种气体被分散在少量液体中的胶体体系（一种气泡），气泡之间被一层液膜隔开，因而彼此不相连通。气泡的生成有两种原因：一种由外界引进的气流被机械破碎而成；另一种由发酵代谢过程中产生的气体聚结而生成。

在好氧发酵中，泡沫的消长有一定的规律，受许多因素控制。高速搅拌、大通风量、培养基中蛋白质原材料及培养基破坏程度较大等均会使泡沫增多；其次，菌种特性与接种量均对培养过程中泡沫的多少影响很大。一般前期泡沫多少取决于菌种的生长速度，生长速度越快，泡沫越少，此时大部分可溶性含氮物易被菌体吸收利用，减少泡沫产生的机会。生长慢的菌种，为了促进生长速度，可提高接种量，如果适当提高罐温，能减少泡沫干扰生长的机会。培养液本身性质变化也影响泡沫消长。如霉菌发酵过程中，在发酵初期，随着发酵的进行，培养液表面黏度下降，表面张力上升，泡沫寿命逐渐缩短；发酵后期，菌体自溶使培养液中可溶性蛋白质增加，又会产生泡沫。此外，培养基的灭菌操作及其方法对泡沫产生也有影响。实罐灭菌操作时，如骤然降低罐内压力会产生泡沫，连续灭菌也比实罐灭菌容易引起泡沫。如果发生染菌现象，则由于杂菌生长，也会使培养基黏度增加而易产生泡沫。

（4）发酵过程的中间补料与控制 培养前期是微生物菌体增殖时期，一般不含或少含有发酵产物，有70%～80%的发酵产物都是在发酵中后期产生。要提高产量，就必须设法延长中期时间。

分批发酵是指一次投料，中间不加养料直到发酵完成。培养至中后期，分泌出的代谢产物越来越多，这时养分也快要消耗完毕，菌体也趋向衰老自溶。如一次投料采用过于丰富培养基，则可延长发酵周期，但高浓度培养基对微生物生长繁殖不利，通气搅拌困难，发酵不易进行，往往在生产上达不到增产目的。

中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料，满足微生物的代谢活动和合成发酵产品的需要。虽然不同产品的发酵过程不同，但补料原则相似。一般要根据微生物的生长代谢规律，结合发酵产品的生物合成途径及实践经验，采取中间补料措施，适当控制和掌握发酵条件。中间补料可促使微生物在培养中期的代谢活动受到控制，延长发酵产物的分泌期，推迟菌种的自溶期，维持较高的发酵产物增长幅度，并增加发酵液体积，从而使单罐产量大幅度上升，因而这一技术已在生产上被广泛采用和推广。

（5）溶解氧的调节控制 酶是大分子，其合成过程需要大量能量，因而必须供给充足的氧气，才能使碳源经有氧降解产生大量的ATP。微生物发酵只能利用溶解在水中的氧气——溶解氧，由于氧是难溶于水的气体，必须不断地提供无菌空气，以满足细胞生长和产酶需要。

溶解氧的调节控制，需根据细胞对氧的需要量进行连续不断的供氧，使培养液中溶解氧维持在一定的浓度范围内。

细胞对氧的需要量与细胞的呼吸强度及细胞浓度密切相关，可用耗氧速率K_{O 2}表示：

式中——耗氧速率，指单位体积（L或mL）培养液在单位时间内（h或min）所消耗的氧化量，一般以毫摩尔氧/小时·升[mmol/（h·L）]表示；

——细胞呼吸强度，指单位细胞量（每个细胞或每克干细胞）在单位时间内（h或min）的耗氧量，以毫摩尔氧/克干细胞·小时[mmol/（g·h）]或毫摩尔氧/个细胞·分钟[mmol/（个·min）]表示，它与细胞种类和生长期有关，不同的细胞呼吸强度不同，同种细胞在不同生长时期，呼吸强度也不同，在产酶高峰期，由于大量合成酶需很多能量，也就需要消耗大量的氧气；

C_C——细胞浓度，指单位体积培养液中细胞的数量，以克干细胞/升（g/L）或个细胞/升（个/L）表示。

在发酵过程中，由于细胞的呼吸强度和细胞浓度各不相同，使耗氧速率有很大差别。因而，要根据需要量提供给适量的溶解氧。

溶解氧的供给，首先是将无菌空气通入发酵罐中，使其中的氧溶解于培养液中，以供细胞生命活动的需要。培养液中溶氧量决定于氧的溶解速度——即溶氧速度或溶解系数，以K_d表示，它是指单位体积发酵液在一定时间内所溶解的氧量。K_d的单位常用毫摩尔氧/升·小时[mmol/（L·h）]来表示。当溶氧速率与耗氧速率相等时，即K_O2=K_d时，培养液中溶解氧保持恒定，可满足细胞生长和产酶需要。

当耗氧速率改变时，必须相应地调节溶氧速率。溶氧速率的调节方法主要有以下几种：

①调节通气量：即单位时间内流过发酵罐的空气量（L/min）。通常以发酵液体积与每分钟通入的空气体积之比表示。例如，1m³的发酵液，每分钟流过的空气量为2m³，则通气量为1∶2。通气量增加，可提高溶氧速率；通气量减少，可降低溶氧速率。

②调节气液接触时间：气液两相接触时间延长，可提高溶氧速率；反之，降低溶氧速率。可以通过增加液层高度，增设挡板等方法以延长气液接触时间。

③调节气液接触面积：从液层底部引入分散的气泡是增加气液接触面积的主要方法；安装搅拌装置，增设挡板等可使气泡打碎，以增加气液两相的接触面积，也可提高溶氧速率。

④调节氧的分压：增加空气压力，提高空气中氧的含量，都能提高氧的分压，从而提高溶氧速率。

以上方法可根据实际情况选择使用，其中常用的是通过改变通风量的方法来调节溶氧速率。例如，在发酵初期用较小的通风量，中期用较大的通风量。