《食品酶学导论》-产酶微生物菌种选育

由于动植物来源分离提取酶制剂受到地域、气候的限制，不易扩大生产。而微生物生长迅速，繁殖速度快，种类繁多（约20多万种）。几乎所有的动植物酶都可以从微生物细胞中获得，而且微生物容易变异，可以通过菌种改良，进一步提高酶的产量。因此，工业酶制剂几乎都用微生物发酵法进行大规模制造的。

产酶的微生物主要是细菌、真菌、霉菌和放线霉等。

现在工业生产的酶制剂大约80%是由微生物来发酵生产的，选择菌种时应考虑以下因素：

①能够利用廉价的原料和简单的培养基，能有效地合成所需的酶；②培养液中菌体易分离，所分泌的酶能用简单办法从培养物中提取出来；③所用菌种应是非致病性的（包括动植物致病性）；④不产生毒素物质；⑤遗传性能稳定，容易保藏，不易退化，也不易遭受噬菌体的感染。

虽然有些微生物可以生产有价值的酶，但由于菌种本身对人体有致病性，也不能应用于食品级酶制的生产。例如，绿脓杆菌的一些菌株能产生蛋白酶，梭状芽孢杆菌可产生医学上有价值的胶原酶，溶血性链球菌的某些菌株也可生产治疗血栓的溶栓酶等，但是，这些菌种有可能危害操作者的健康。

有些菌株通过人工诱变可以增加酶的产量，但有时也能增加有害物质的代谢产物，对此也不能采用。

多数放线菌可以产生抗生素，也有可能产生交叉抗性（即引起抗药性）。有些霉菌培养时会产生各种霉菌毒素，其中有曲酸、青霉酸、黄曲霉毒素、棕曲霉毒素等多种有害物质。

霉菌毒素引起动物中毒，伤害肝脏、大脑与神经系统，可引起肝硬化、肝炎、肾炎以及大脑、中枢神经出血等病症，尤其是黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素G₁，黄变米毒素（luteoskrin）等还会致癌。故在未能证明一个菌种不产生毒性物质时，不宜用于生产。此外，长霉的原料也会将毒素带入产品，也不可忽视。为了保障应用与生产的安全，必须有一个严格的规定，世界卫生组织（WHO）在1971年对酶的生产与应用曾作以下规定：

（1）凡是动植物可食部位的组织或用传统微生物所生产的酶可作为食品对待，不需做毒性试验。例如，动物胰酶、胃酶、凝乳酶、麦芽淀粉酶和酵母、乳酸菌和黑曲霉制得的酶，一般认为是安全的。只需建立酶化学与微生物化学的详细说明即可，但来自植物非可食部位的酶应通过毒性试验予以鉴定；

（2）凡由非致病性的一般食品污染微生物所生产的酶，需做短期毒性试验鉴定，其中枯草芽孢杆菌制得的酶一般认为是安全的；

（3）对于非常见微生物所提取的酶，应作全面广泛的毒性试验，包括慢性毒性试验在内。

此外食品工业也不能使用那些与治疗用酶抗原性相近似的酶类。

对于一个新开发的食品用酶制剂，均必须全面进行如表6-3所示的各项安全试验。制造厂为图节省费用，常在已经确认是安全的传统菌种中筛选。尤其是食品工业用酶，为保证菌种安全需按照监管部门有关规定进行生产。例如，美国需得到食品与药物管理局（FDA）的批准，已经同意使用于酶制剂生活的微生物只限于黑曲霉、米曲霉、酵母、枯草杆菌以及放线菌等20多种（表6-4）。

对于工厂生产的酶制剂，每一批都需做表6-5所述的卫生学检查。

此外，还有黄曲霉毒素B₁、赫曲霉毒素A₁、柄曲霉毒素、F2毒素以及玉米赤霉烯酮等也在测定之列。

表6-3 食品用酶制剂的毒性试验

表6-4 美国政府同意使用的食品用酶及生产菌种（1981）

表6-5 酶制剂的卫生字检查

1.菌种来源

一般情况下，菌种来源可以从国内外菌种保藏机构索取，全世界有51个国家349个保藏机构的名录（见附录）。中国科学院微生物研究所设有全国菌种保藏委员会，美国有国立菌种保藏会（ATCC）、北部研究所（NRRL）等。

不同的材料栖息着不同的微生物群，从霉烂果蔬上可分离出各种能产生果胶酶的微生物；从酿酒厂、淀粉厂车间周围的土壤和污泥可分离出能分泌淀粉酶的微生物；从酱油厂、制革厂原料库、屠宰场、豆制品工厂污水污泥以及猛禽猛兽粪便中可分离出蛋白酶的微生物；从朽木、稻草堆垛可分离出纤维素酶菌种等。

土壤是微生物丰富的宝库，1g土壤中蕴藏着亿万个微生物，尤其是耕地、森林等肥沃土壤中含菌量丰富。不同酸度、土质以及不同植被的土壤，其所栖息的微生物类群不同。好气性细菌、放线菌、霉菌常栖居在通气环境良好的土壤；霉菌、酵母菌常栖息在带酸性的土壤；在盐碱地、温泉、海边土壤可以分离出耐碱性、嗜碱性、耐热性、耐盐性的菌种。

2.产酶菌种分离方法

（1）平板分离法 首先将含菌样品用无菌水制成悬浊液，在适度稀释后（以每个平板形成菌落10～13个为宜），涂布在琼脂平板，置一定温度下培养1～5d，将形成的菌落移植于斜面，供筛选之用。细菌可用肉汁琼脂培养基（pH7.0）在37℃培养；霉菌可用察氏琼脂培养基（pH5.5）30℃培养。为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可在培养基中加0.1%去氧胆酸钠或0.1%山梨糖；放线菌通常可用高氏培养基（pH6.8～7.0）20～30℃培养。为了提高菌种分离效率，培养基中加入30～50U/mL制霉菌素、克念菌素、杀霉素等多烯类抗生素等以抑制霉菌生长。若向培养基添加青霉素、链霉素（30U/mL）、四环素或孟加拉红（0.001%），则可抑制细菌而不干扰霉菌的生长。用碱性或酸性培养基，可分离耐碱、耐酸微生物。用添加高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物。在高温下培养可筛选耐热微生物。分离芽孢杆菌，可先将样品于80～90℃加热10～15min，以杀死不产芽孢微生物后再进行分离。

（2）富集培养法 将土样加入培养基中或将特定底物加入土壤中，在一定温度下培养，使微生物繁殖后再进行分离。例如，添加蛋白质可富集蛋白酶生产菌，添加淀粉质可富集淀粉酶生产菌种，添加纤维素可富集纤维素酶生产菌种，添加油脂可富集脂肪酶生产菌种等。

3.产酶微生物的筛选

（1）初筛 一般将分离出的菌种采用固体培养基或液体培养基进行培养，并测定培养物的酶活力。例如，筛选 α-淀粉酶生产菌种时，可在平板分离培养基添加适量可溶性淀粉（0.1%～0.5%）培养后，如生成的菌落周围产生透明的水解圈，则表明有 α-淀粉酶产生。水解圈直径越大，酶活力越高。

采用平板培养时，水解圈的大小并不完全与实际生产一致。因此，必须通过复筛来确定。此外，水解圈的大小也受到平板培养基厚度、培养皿底是否平坦等影响。即使正常情况下水解圈的大小也不一定同酶活力成比例。酶活力大大增加时，水解圈的直径增加并不多，因此，有人主张用水解圈直径（D）除以菌落直径（d），即来进行校正。

关于分解圈直径与产酶活力间的关系可用式（6-1）来表示。

式中[ E] ——产酶浓度；

D——菌体量；

R——水解圈直径；

r——菌落直径；

Δ——琼脂厚度；

[c]——底物浓度；

t——培养时间；

k——常数。

（2）复筛为了筛选高产菌株，一般都用1～2种培养基，在固定培养条件下对每一个菌株进行复筛，菌株多时对每一株做一份试验，从中优胜劣汰。在复筛时，优选的菌株可以增加重复复筛次数，一个菌株同时做3～5份培养测定，以增加其精确性，经过多次重复，筛选出稳定的高产菌株。

液体培养筛选菌种时，一般都用摇瓶培养，将菌种接种在三角瓶液体培养基中，在一定温度下作振荡培养。但是，摇瓶培养测定的结果，也不一定与发酵罐中通气搅拌培养的结果相同。为了使培养物接触空气，发酵罐中的搅拌器均匀翻拌，但其剪切作用有时会造成菌丝断裂而对生长及产酶不利。摇瓶培养时，培养瓶（一般是三角瓶）中所装培养液的体积对产酶影响较大，装液量少，意味着通气量大（液体与空气接触面大）；装液量大，代表通气量小。同时，培养基的组成、摇瓶培养的振荡速度对产酶也有影响。

自然界分离的野生型菌株产酶能力很低，很少适合于工业生产。一般，工业上所用菌种几乎都是屡经选育的变异株。目前，已有可能选育酶蛋白占菌体蛋白2/3的高产菌株，α-淀粉酶活力已达10000U/mL，是20世纪50年代的50倍，每升发酵液中酶蛋白结晶高达6～7g，占发酵液总氮量的40%。

菌种改良包括人工诱变和原生质体融合、DNA重组等手段。人工诱发突变属随机选择的方法，虽然已经使用了40年，但至今仍是常用、有效的方法。突变是利用紫外线（UV）、X射线、⁶⁰Co、γ射线等辐射光或用甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝酸等化学药品处理微生物群体，杀死其绝大部分，从残存微生物中可得到少数发生了突变的菌株。美国农业部北方地区研究室（NRRL）曾利用该方法，使青霉菌产青霉素效价提高了10000倍以上。

1.筛选抗药性突变株

此法是将人工诱变处理后的材料（霉菌孢子或细菌细胞悬浮液）涂布在含有对野生型有抑制的试剂或抗生素的琼脂平板上，此时只有抗药性的突变株能够生长。某些抗生素可干扰细胞壁的合成，抗性株的细胞结构可能发生变化，抗药性同产酶能力之间可能存在某种联系，故可作为筛选高产突变株的一个标记。例如，筛选枯草杆菌衣霉素抗性突变株，得到抗衣霉素浓度为50μg/mL的突变株B₇，其α-淀粉酶产量提高5倍。从地衣芽孢杆菌NYK74的抗环丝氨酸突变株，筛选得到耐热性α-淀粉酶高产的突变株。随着抗药剂量的增加，产酶能力递增，从抗环丝氨酸为400μg/mL的突变株，得到产酶能力提高2000倍的突变株SMN11。衣霉素同环丝氨酸的抗菌机制虽然不同，但都可抑制细胞壁的合成。

细菌α-淀粉酶、β-淀粉酶以及蛋白酶等胞外酶的生物合成也与芽孢形成有密切关系，筛选无孢子突变株也许能够增加这些酶的合成与分泌。无孢子突变株可用氯仿熏蒸、斜面培养或镜检来验证，将生成的菌落用氯仿熏蒸，凡无孢子突变株经此处理就死亡。筛选得到耐热性α-淀粉酶提高200倍的突变株，从而可用于工业生产。

表6-6所示为我国近年来在产酶菌种选育上所取得的成果。

表6-6 突变株及其产酶能力

续表

2.突变株的筛选方法

由于突变菌体的产酶能力一般很不稳定，因此必须反复地进行自然选育，才能使之稳定。

常用的诱变剂是UV、电离射线（γ射线、X射线等）、硫酸二乙酯（DES）和亚硝基胍（NTG），这些诱变剂的作用机制各不相同，不同的诱变剂只对微生物的遗传物质（基因）的某一部分发生作用，对不同微生物的效果也不同。诱变处理时的环境对诱变的效果有一定影响，例如，用NTG处理微生物时一般在pH6左右进行，近来的报道认为在pH9处理的效果更佳。虽然目前还不能在分子水平上确切提出改进一个菌株需用那一类型的突变，但使用几种诱变剂作复合处理可得到更多的突变类型。(www.chuimin.cn)

关于诱变剂剂量的选择，应是能使突变株存活菌株中占有最大的比例为目的。过去曾认为高产突变株需在大剂量诱变剂在致死率99%以上的条件下容易获得突变株，但经验告诉我们，高产菌株往往是在存活率较高（诱变剂量较低）的情况下出现，高剂量诱变未必好，因为它还易诱发不良性、继发性突变。

霉菌诱变时，为防止突变株的退化，应避免使用多核的孢子或菌丝片段作材料，即使是单核孢子也会出现孢子团，故必须将孢子充分分散。诱变之后紧接着的是自然分离，反复分离使混合核得以分离而成为纯菌落。

通常高产株出现的概率很低，且筛选实验的误差也较大，采取多级筛选将容易获得优良的突变株。

1.化学诱变剂处理

（1）硫酸二乙酯（DES）处理对细菌而言，先将细菌在肉汤37℃培养过夜，然后离心将细胞沉淀，用无菌水洗涤后，加入pH7.0磷酸缓冲液制成一定浓度细胞悬液，加入浓度2%的DES溶液，至一定浓度（一般0.1%～1%），放置一定时间（40～60min），在肉汁平板37℃培养24h。

对霉菌而言，将孢子在三角瓶中用玻璃珠振荡数分钟后用脱脂棉过滤，制成分散均匀的孢子悬浮液（10⁶个/mL左右），然后加入一定量的DES（浓度0.5%～1%），30℃振荡处理一定时间（30～60min），取作用液0.5mL加入4.5mL解毒液（25%Na₂S₂O₃液）中终止反应，稀释到一定浓度后涂平板培养。

（2）亚硝基胍（NTG）处理NTG属于烷化剂的一类诱变剂，是一种土黄色的结晶，不稳定，遇光易分解而释放出一氧化氮。同时颜色转变成黄绿色，难溶于水，使用时先用少量丙酮溶解再用水或缓冲液稀释。

进行诱变时，将NTG配成浓度1～10mg/mL的溶液，先将细胞用pH6.0缓冲液制成一定浓度（细菌5×10⁸个/mL，霉菌孢子10⁶个/mL），加入NTG溶液使之达一定浓度（一般为100～500μg/mL），在30℃（霉菌）或37℃（细菌）振荡保温一定时间（10～120min），用多次离心洗涤或用生理食盐水或缓冲液做大量稀释，然后涂布平板进行分离培养。

（3）亚硝酸处理 亚硝酸可使DNA分子的嘌呤、嘧啶或碱基氧化并进行脱氨作用，最后氨基为羟基所取代而发生突变。此外，还能引起两条DNA链的交联造成碱基缺失而发生突变。亚硝酸是一种毒性较小、容易控制、诱变效率较高的诱变剂。亚硝酸很不稳定易分解。通常亚硝酸是用亚硝酸钠溶解于0.1mol/L pH4.6的乙酸缓冲液中而制成。

诱变时将细胞悬浮在0.1mol/L pH4.6的灭菌乙酸缓冲液中，取2mL放入无菌小瓶中，加入0.1mol/L亚硝酸钠溶液和pH4.6乙酸缓冲液各1mL混匀（HNO₂终浓度约0.025mol/L）在一定温度保温一定时间（10～20min），取出2mL反应液加入10mL 0.07mol/L pH8.6的磷酸氢二钠溶液中以终止作用，稀释后涂平板培养。

2.物理诱变法——紫外光处理

紫外光是最安全经济、最常用的非电离辐射诱变剂，紫外光位于可见光紫光的外侧，波长为400×10^-10～3000×10^-10m，因DNA分子对波长2600×10^-10m的紫外光有吸收，故波长2000×10^-10～3000×10^-10m的紫外光才能引起诱变作用。突变作用的用紫外光诱变时，先将细胞用生理盐水制成分散良好适当浓度的悬浮液（细菌10⁸个/mL，霉菌孢子10⁶～10⁷个/mL），吸取4～5mL加入直径9cm平底培养瓶中，在避光下于紫外灯下一定距离处照射一定时间，每隔一定时间吸取0.1mL，用生理盐水稀释10倍后（使每个平板菌落控制在20～50个）涂平板培养。在使用前，紫外灯应提前开启30min使光波稳定。

紫外光照射剂量的强度通常以每秒钟每平方厘米接受的能量来表示的，一般用10W、30cm长、8mm直径的石英紫外灯管，在距离10cm的照射强度约为10^-3J/（cm²·s）。因一般实验室中无剂量仪，则可用致死率或照射时间与离光源的距离来表示相对照射剂量，通过改变照射时间或距离来改变剂量，一般在灯管长度的1/3范围内，强度与距离成反比关系。

3.理性化微生物菌种改良

传统的菌种改良是通过某一适当菌株进行诱变，然后再分离单个菌株进行直接的效价测定，但带有一定的盲目性。运用已掌握的遗传学和代谢途径，可以更科学地设计菌种筛选的方法，使突变型菌株带上某些遗传标记，在外观表型上，突变株与未突变菌株有效地分开来，这种方法称为理性化菌种筛选技术。此法主要包括如下几种：

（1）营养缺陷型 通过诱变以获得某种营养缺陷型。即营养上有缺陷的突变型培养在一种培养基中，其中添加的某种或某几种物质为维持菌株生长所必需的，而另一种添加进去则不能生长便成为某种营养缺陷型菌株。

（2）回复突变型 有的菌株获得某种营养缺陷型后并不稳定，往往需采用第二次突变，以抑制第一次突变，达到高产稳定的营养缺陷型菌株。

（3）反馈抑制抗性突变型 终产物与酶特定结构部位（或变构部位）结合，引起酶的构象变化，从而抑制酶活力。代谢终产物往往会抑制代谢途径中的酶活力。在育种实践中，使突变株带上营养缺陷和抗代谢类似物的遗传标记，其产量随着这类标记的增加而增加。

（4）抗阻遏突变型 分解代谢各步骤的前体往往会调节生物合成酶的表达量，操纵基因位点和调节基因位点发生突变则可减弱终产物酶的合成，从而提高其发酵率。

（5）组成型突变型 这种突变型是依靠培养条件或诱导物质的存在。可以过量表达淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脂肪酶或蛋白酶。

4.耐高温α-淀粉酶菌种选育实例

目前，国内外淀粉糖生产所采用耐高温 α-淀粉酶生产菌种均为地衣芽孢杆菌的突变株。丹麦Novozyme公司Outtrup等将地衣芽孢杆菌ATCCP9798作为出发菌株，经物理与化学方法反复处理，使α-淀粉酶活力提高了25倍。日本丸尾等以地衣芽孢杆菌NYK74为出发菌株，采用亚硝基胍（NTG）为诱变剂，反复连续诱变及自然选育6次，挑选环丝氨酸抗性突变菌株，发现耐高温淀粉酶产量随抗药性剂量增大而增大。在抗环丝氨酸剂量为400μg/mL的突变株中，得到一株产酶比出发菌株活力提高2000倍的菌株，如图6-15所示。

图6-15 耐高温α-淀粉酶生产菌种诱变育种过程

NTG-亚硝基胍

基因工程是在分子水平上，通过人工方法将外源基因引入细胞，而获得具有新遗传性状细胞的技术。

要将目的基因引进到细胞中，必须由能够独立地进行自我复制的载体来携带。通常用作的载体有细菌质粒和病毒DNA等。

质粒（plasmid）是染色体外的遗传因子，是一种双链闭环的DNA分子。质粒本身含有复制基因，能在细胞质中独立自主地进行自我复制。常用基因载体的质粒如pBR₃₂₂、Col E₁、PSC₁₀₁、PMB₁、PCR₁等，都是经过人工改造的，带有一定的抗药性标记，具有一种或几种单切口的限制性内切酶切点。

目前，国内外普遍采用的载体质粒是pBR₃₂₂，它的分子质量为2.6×10⁶u，具有抗氨苄青霉素（Amp^r）和抗四环素（Ter^r）的标记。含有ColE₁的复制起始区，在氯霉素存在下能够扩增为多拷贝质粒，具有PstI、E.coRI、HindⅢ、BamHI和SstI等多种限制性内切酶的单切点。

质粒Col E₁是产生大肠杆菌素E₁的质粒，它的分子质量为4.2×10⁶u，在一个细胞中有20～24个拷贝。在氯霉素存在下，每个细胞中可扩增到数千个拷贝。对E.coRⅠ酶只有一个切点，但E.coRⅠ作用后破坏了产生大肠杆菌素的基因，对克隆菌株的筛选较困难。为此常在ColE₁上附加抗药性标记，当ColE₁质粒加上抗卡那霉素的标记后，即成为质粒PCR₁。

质粒PSC₁₀₁是大肠杆菌R6-5质粒经切割后产生的小质粒，分子质量为5.8×10⁶u，带有抗四环素标记和复制区域，对E.coRI和HindⅢ都只有一个切点。

质粒PMB₁是由Col E₁和PSC₁₀₁组成的，分子质量为3.5×10⁶u，带有抗四环素标记和复制区域，对E.coRⅠ和HindⅢ都只有一个切点。但HindⅢ作用后破坏其抗四环素标记，能够用作基因扩增。

用作基因载体的病毒通常是λ-噬菌体，它的寄主为大肠杆菌，其遗传结构和功能都已搞清楚。λ-噬菌体能在大肠杆菌细胞中大量繁殖，有利于外源基因的扩增。

另一类基因载体是由质粒和λ-噬菌体DNA的黏性末端（COS区）组建而成，称为柯斯米德（Cosmide）。它既具有质粒的性质，又能为λ-噬菌体外壳蛋白所包装而具有感染大肠杆菌的功能，能将重组体注入到寄主细胞中。柯斯米德能组装很大的外源基因，DNA片段的长度可达30～40kbp。

基因载体的分子质量一般在10⁶u范围内，而且绝大多数都是共价闭合环状的DNA分子（cccDNA）。这种cccDNA比较稳定，不易变性。根据这些特性，可用蔗糖密度梯度离心法，氯化铯-溴化乙啶（CsCl-EB）密度梯度离心法，硝酸纤维素膜吸附法，聚乙二醇（PEG）沉淀法等，使其与染色体DNA分离。

在基因工程中还要采用一系列的酶用于切割、连接合成或转移等作用，统称为工具酶，其中限制内切酶Ⅱ是其中一种。还有DNA连接酶、T₄多聚核苷酸激酶、碱环磷酸酯酶等，常用的工具酶有500多种。

限制性内切酶是一类专一性很强的内切核酸酶。它们在特定的位点，作用于DNA的磷酸二酯键。它们的识别序列为4～6个碱基对。识别四个碱基对的限制性内切核酸酶。

体外组建的重组体（杂种DNA）只有引入寄主细胞内进行扩增和表达，才具有学术价值和实用的意义。所使用的载体不同时，采用的引入细胞的方法也不一样。以质粒DNA为载体时，采用细胞转化的方法。

接受重组体的受体细胞一般是经过筛选得到的限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切核酸酶和甲基化酶的突变体。大肠杆菌受体细胞一般都采用大肠杆菌K₁₂的变异株。受体细胞用Ca^{2 +}处理后呈感受态，其细胞膜出现变化，能让DNA分子通过而进入细胞内。将含重组DNA分子的溶液在一定条件下与用Ca^{2 +}处理过的感受态受体细胞混合后保温，重组体即可进入受体细胞。用培养基稀释Ca^{2 +}浓度，基因便可进行表达，而把外源基因带来的性状赋予受体细胞，便可实现基因转移，使受体细胞出现新的遗传性状。细菌质粒的转化效率为10⁵～10⁷转化体/μg DNA。一般而言，质粒的分子越小，转化效率越高，环状分子比线状分子转化效率要高。

若用噬菌体DNA为载体，则可用转导的方法使重组DNA直接进入经Ca^{2 +}处理的受体细胞，转导效率可达10⁵～10⁶噬菌斑/μg DNA，若用λ-噬菌体的外壳蛋白包装重组体，则可大大提高转导效率。

经转化或转导以后获得的转化体（克隆化菌株）通常是利用抗药性、噬菌斑营养缺陷互补、某些酶的显色反应等方法进行平板筛选，也可以利用分子杂交的方法筛选出转化体。

获得克隆化菌株后，可再将重组体分离，进行限制内切酶分析，采用凝胶电泳或放射自显影等方法进行鉴定。也可进行基因产物的测定，而对重组体作出明确的鉴定。

1979年，Nomura等报道了采用基因工程改良产α-淀粉酶的菌株，将AmyE克隆到枯草杆菌得到具有α-淀粉酶活力的菌株。Palva等采用PVB₁₁₀载体，将液化淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的α-淀粉酶基因克隆到枯草杆菌中，获得抗卡那霉素转化株，其α-淀粉酶活力比野生型原始菌株高500倍。最近，Henaham分离纯化地衣芽孢杆菌的高产 α-淀粉酶产量可提高7～10倍，并且已广泛应用于食品工业中的淀粉液化和酿酒工业。

制造干酪的凝乳酶（chymosin）是把小牛胃中的凝乳酶基因克隆至细菌或真菌中，在20世纪80年代初已克隆成功，1990年美国FDA批准上市，为世界干酪生产解决了酶源问题。Nishimori等于1981年首次用DNA重组技术将凝乳酶基因克隆到大肠杆菌（E.coli）中并成功表达。1984年Marston和1987年Kawaguchi根据电泳扫描结果确定，凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达水平为总蛋白的8%和10%～20%。1986年Uozumi和Beppu报道从每升发酵醪的菌体中可获得13.6mg有活性的凝乳酶。后来，把酶基因导入酵母中也表达成功。1990年Strop把携带原基因的质粒PMG13195导入大肠杆菌（E.coli）的金属含硫蛋白基因（MT）中，获得有凝乳酶活力的工程菌，其表达效率为1mg/g湿菌体。

生产面包的面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）也是采用基因克隆技术改造的。其方法是把具有优良特性的酶基因克隆至该酵母中，从而使该酵母含有的麦芽糖透性酶（maltose per-mease）和麦芽糖酶（maltase）的活力比原宿面包酵母高，使面包加工中产生的CO₂气体量增加，面包发酵膨发性增加，成品特别松软可口，也可延长其货架期。

罗进贤等构建了能分解淀粉的酵母工程菌，利用酵母G418抗性基因neo构建了整合型酵母表达载体YIP28 D.17N转化GRF18后获得整合型酵母工程菌GRF18，酒精含量在10%以上，达到传统方法生产酒精的技术水平。

又如，王立梅、齐斌等通过反向转录PCR法成功地扩增出日本曲霉β-呋喃糖苷酶基因片段，长度为1917bp，编码638个氨基酸，将所得出片段定向克隆到Pyx212载体上，并转化至酵母中，通过酵母菌落PCR检测后，确定该基因在酿酒酵母中获得表达，转化子平均酶活力为26.4U/mg。

许多微生物中都有β-半乳糖苷酶，但由于受到使用时酶残留的安全限制而不能用于食品体系。因此，可通过基因重组技术将其基因转入GRAS级的微生物细胞作为宿主（如Bacillus subtilis等），在宿主调节基因的调控下，在发酵罐中规模生产表达有优良特性的β-半乳糖苷酶基因。Walsh D.J.等利用β-半乳糖苷酶基因LAC₄表达产物占胞外蛋白的90%，摇床培养分泌出的木聚糖酶活力最高可达130U/mL，是大肠杆菌表达系统的300倍。

基因工程应用于改良产酶菌株性能已较普遍，其他方法（如细胞融合技术等）也已得到有效应用。许多研究表明，可通过基因工程手段提高生活细胞生物合成酶的效率。