食品酶学导论：酶在非水介质中的催化

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：根据非水介质酶学研究进展，其主要研究有机溶剂为主的微水有机溶剂中和反相胶束中酶结构与性质，催化动力学、催化条件、反应机制及其应用等内容。有大量实验表明，酶悬浮于苯、环己烷等有机溶剂中并不变性，而且还能表现出催化活性，并认为酶的活性部位结构在水中与在有机溶剂中是相同的。

1966年以来，F.R.Dostoli和S.M.Siegel报道了胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种非极性有机溶剂中具有催化活性。后来，采用游离酶、微生物细胞和固定化酶在有机溶剂中用于合成酯和类固醇也取得类似的进展。直至1984年，美国A.M.Klibanv在《科学》杂志上发表了关于酶在有机介质中催化作用一文，成功地在仅含微量水的有机介质中进行酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物，开创了非水介质酶学理论。

根据非水介质酶学研究进展，其主要研究有机溶剂为主的微水有机溶剂中和反相胶束中酶结构与性质，催化动力学、催化条件、反应机制及其应用等内容。

酶在水溶液中是均一地溶解或存在于水溶液中，而酶不溶于疏水性有机溶剂，而在含微量水（1%以下）的有机溶剂中以悬浮状态起催化作用（图5-21）。有大量实验表明，酶悬浮于苯、环己烷等有机溶剂中并不变性，而且还能表现出催化活性，并认为酶的活性部位结构在水中与在有机溶剂中是相同的。

D.S.Clark等首次采用电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）技术研究了固定化乙醇脱氢酶在有机溶剂中的构象，表明了固定化乙醇脱氢酶在有机溶剂中能够保持天然构象。Klibanov等将 α-溶菌酶直接悬浮于无水丙酮中，采用固态¹⁵N标记的组氨酸的化学位移，也证明组氨酸在丙酮中的化学位移与在水溶液中位移相同。

图5-21 酶分散在有机溶剂中的反应体系

但是，并非所有的酶悬浮于任何有机溶剂中都能维持其天然构象。Burke用固态核磁共振方法研究了α-胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥、向酶粉中添加有机溶剂后观察其活性部位的结构变化，结果显示冻干作用能造成42%活性受到破坏，当加入冻干保护剂（如蔗糖）时，能不同程度地稳定其活性部位结构。酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥其催化功能，而酶悬浮于微量水（＜1%）的有机溶剂时，与蛋白质分子形成分子间氢键的水分子极少，导致氢键减弱，蛋白质结构变得“刚硬”（ri g-id），活动的自由度变小。蛋白质的这种动力学刚性（kinetic rigidi）限制了疏水环境下的蛋白质构象向热力学稳定状态转化。

自1997年以来有关学者已研究了酶在反相胶束中的结构变化。研究得比较多的是水溶性蛋白质（包括单体酶和多聚体酶）、一些膜蛋白（如细胞色素氧化酶、肌浆网状体Ca-ATP酶、亚线粒体ATP酶）和附着生物膜表面或介于两膜表面之间的蛋白质（如细胞色素C、髓磷脂碱性蛋白）三种。此三种酶在反相胶束中的排布模型如图5-22所示。

图5-22 不同类型的酶在反相胶束中的排布模型

（1）可溶性酶（2）通常情况下附着于生物膜表面的酶（3）膜整合蛋白

其中水溶性酶被水分子所包围，当水与表面活性剂的比率较低时，蛋白质分子与胶束的极性表面接触，往往会对蛋白质分子进行修饰；存在于两膜之间或附于膜上的髓磷脂碱性蛋白和细胞色素C在反相胶束中，它们与胶束的内表面相接触，如细胞色素氧化酶、线粒体ATP酶等整合蛋白具有一疏水部分，被埋入膜的非极性区域。因此，在反相胶束中，蛋白质的极性部分与胶束的水池相接触，而疏水部分与有机溶剂相接触。反相胶束是一种热力学稳定、光学透明的溶液体系。光谱学可以作为探测反相胶束中酶的结构、稳定性和动力学行为。吸收光谱的圆二色性、荧光光谱和三态光谱对检测反胶束中的酶活力有着实际应用。溶菌酶与反相胶束结合后，圆二色性发生变化，而乙醇脱氢酶和硫辛酰胺脱氢酶与反相胶束结合后则无变化。荧光光谱法用于反相胶束中几种多肽类激素和溶菌酶的研究，可以测出荧光基团的动态情况，发现色氨酸残基的转动受到限制。而三态光谱法则可测定反相胶束间的交换速率，可作为研究蛋白质和反相胶束表面活性剂之间相互作用的探针。

早在1966年，Dastoli和Price在研究胰凝乳蛋白酶和黄嘌呤氧化酶在微水有机溶液中的催化反应时，发现酶在有机溶剂中不仅能保持天然活性，而且符合Michaelis-Menten动力学模式。研究得最多的是缬氨酸类蛋白酶，包括枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。这些酶在水溶液中是通过酰基-酶机制水解底物肽或酯。即酶与底物首先通过非共价键形成酶与底物复合物，然后酶活性部位的缬氨酸残基的羟基与底物的羰基形成四面体中间物。(www.chuimin.cn)

研究水溶液中酶促反应动力学时，其扩散限制和水分活度可忽略。而在微水有机溶剂中酶促反应扩散限制尤其内扩散限制则不能忽略，它与酶活力颗粒大小、形态以及底物性质有关。

例如，环己烷中脂肪酶催化消旋2-辛醇与辛酸的不对称合成反应动力学的研究。为了考察内扩散限制的影响，在无外扩散的条件下测定酶浓度对反应初速度的影响，反应初速度与酶浓度（0～60mg/mL）呈直线关系，说明在该实验条件下不受扩散限制的影响，仅受动力学控制。在振荡频率150r/min、酶浓度4mg/mL的条件下，测定底物浓度对反应初速度的影响和表观动力学常数，固定不同辛酸浓度，改变外消旋2-辛醇的浓度，分别测定R型2-辛醇和S型2-辛醇两种异构体的酯化初速度，并与各自的浓度作双倒数图，如图5-23（1）、（2）所示。

图5-23 2-辛醇两种异构体（R型或S型）的浓度与各自酯化反应初速度的双倒数图

（1）（R）-2-辛醇（2）（S）-2-辛醇1-0.0382-0.0513-0.0694-0.1145-0.0341

以图5-23（1）、（2）中横轴截距（即K_m的倒数）对辛酸浓度（c）的倒数作图得图5-24（1），以图5-23（1）、（2）中纵轴截距（即V_m的倒数）对辛酸浓度的倒数作图得图5-24（2）。

图5-24 以图中横轴截距和纵轴截距分别对辛酸浓度倒数作图

1-（R）-2-辛醇 2-（S）-2-辛醇

为了系统地研究反相胶束中酶催化动力学，许多学者提出了多种不同的动力学模型，包括扩散模型和非扩散型。对于前者，必须考虑反应物在介质中的流动，以及底物从溶液扩散到酶周围的速度。而对于反相胶束，除了穿过界面，底物的流动还可以直接从一个液滴到另一个液滴，胶束扩散速度依赖于周围有机溶剂的黏度、胶束大小及温度；而非扩散模型，这种模型假设动力学参数K_{c a t}和K_m的变化是蛋白质在反相胶束中结构变化的结果。

非水相酶催化反应技术的应用始于20世纪80年代后期，当时界面酶学和非水酶学的研究取得突破性进展，极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的开发。随着油脂加工业的发展和高品位的脂肪食品的开发，有机相的生物催化成为当今酶工程学的研究热点之一。在食品添加剂生产领域，利用固定的有机相中脂肪酶催化作用，把廉价的棕榈油和乌桕脂经酯交换反应，变成可口的类可可脂，能很好地应用于巧克力糖果的生产。国外利用酶促酯交换反应把廉价的油脂转变成高品质的食用油脂的研究也很活跃，Eigtved等用人造奶油和不饱和脂肪酸的交换反应，使人造奶油熔点降低，改良了人造奶油的质量。山根等用脂肪酶选择性水解鱼油，使鱼油中n-3PUFA含量由原来的15%～30%提高到50%。Okada等用脂肪酶在微水介质中催化鱼油的酯交换反应也得到富含n-3PUFA的甘油三酯。Yoshimoto等用PEC脂肪酶催化二十碳五烯酸（EPA）和二棕榈酰磷脂酰胆碱的酯交换反应，制备了二十碳五烯酰棕榈酰卵磷脂（EPPC）。这种含高不饱和脂肪酸的卵磷脂具有细胞分化诱导作用，可作为癌症治疗药物。袁红玲、汤鲁宏、陶文昕以氢化棕榈油、大豆油和海狗油等为脂肪酸基团供体，在固定化脂肪酶的催化下，有机溶剂中与L-抗坏血酸直接进行酯交换反应形成L-抗坏血酸脂肪酯。初始油脂底物浓度200～600mmoL/L，温度55℃，反应时间为9h，在此条件下产物质量浓度可达43.51g/L。罗志刚、杨连生、李文志采用Novozyme 435脂肪酶，叔丁醇为底物，40℃水分活度0.66～0.85，pH10，加酶量4mg/mL，肌醇和烟酸最适摩尔比为1∶6，而烟酸浓度低于6.0mmoL/L时，产物生成率可达89.00%。总之，非水溶剂中酯催化反应技术在食品添加剂生产中的应用具有很大的发展潜力。

据统计，我国每年在粮食加工中产生1000多万吨米糠，其含油量为16%～22%，即为160万～220万t油量。米糠油畅销国内外市场，而我国约有90%的米糠得不到加工，米糠油中含游离脂肪高达15%以上。因此，米糠油的精炼是急需解决的技术问题，主要有物理法、化学法和酶法三种解决方法。物理法生产效率低，而且存在副反应；化学法精炼得率低，而且生产大量废水和皂角，还会造成维生素E、谷维素等功能成分损失。因此，酶解法的优点则可以解决前两法的缺陷。近年来，国内外酶工程技术的研究已能成功地解决米糠油脱酸的难题。在实验室条件下，采用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，经过8h的催化反应，可将米糠油中的游离脂肪酸由14.47%降为2.50%，其主要成分甘油三酯的含量由74.68%升至84.35%。目前，这一新技术已进入中试阶段。

食品酶学导论：酶在非水介质中的催化

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