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食品酶学导论：单底物酶促反应动力学

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：，如果K0远小于K-1，则米氏常数Km的含义：Km是酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。其数值为一个常数，但可在严格规定条件下测定，通常以mo l/L表示。实质上Km是酶与底物亲和力的量度，Km值大表明K1小，E和S的亲和力小。例如，酵母菌脱羧酶的反应，经过实验求得表5-2所列的数据。并求出该酶的Km及vm。

1902年Henrri在研究蔗糖酶催化水解蔗糖的反应中发现其反应速度随着底物的浓度增加而增加，当其底物增加到一定浓度时，酶催化反应速度达到恒定状态即最大值，底物浓度[S]对速度v作图，便形成“双曲线”图形，并提出中间产物学说以解释酶的催化作用原理。

1913年L.Michaelis和M.L.Menten根据中间产物学说对“双曲线”反应图形加以数学推导，提出所谓快速平衡假定（rapid equilibrium，即R.E.假定）：

（1）测定的速度为反应的初速度，底物浓度[S]消耗很少，仅占[S]原始浓度的5%以内，故在测定反应速度所需时间内，P的生成极少，（P+E）的逆转可以忽略不计。

（2）底物浓度[S]大大地超过酶的浓度[E]。因此，ES的形成不会明显地降低底物浓度[S]。例如，[S]=10^-3mol/L，而[E]=10^-9～10^-8mol/L，所以即使所有[E]都变为ES，此时[S]的降低仍可忽略不计。

（3）ES解离成E +S的速度也大大超过ES分解而形成（P+E）的速度，即K_-1≫K₀或者的可逆反应在测定初速度v的时间内已达到动态平衡，而少量P的生成不影响这个平衡，故称为快速平衡假定。

假设E S形成E +S的解离常数为K_s，因此：

若E的原始浓度为[E₀]，在反应平衡时，E的浓度变为（[E₀]-[ES]），而此时根据上述假定（2），S的浓度[S]保持不变。故式（5-1）变为：

由于反应速度v取决于[ES]，即v=K₀[ES]，

当[S]为极大时，全部E转变为ES，[ES] = [E₀]，此时v=v_m（最大反应速度），故v_m=K₀[E₀]，即：

将式（5-5）和式（5-6）代入式（5-4），可得：

式（5-8）即为M-M两氏根据快速平衡假定推导出的米氏方程式。

如果将式（5-8）移项整理可得：

由于v_m和K_s均为常数，而v及[S]为变量，故式（5-11）实际上可写成（x-a）（y+b）=k，实质上为典型的双曲线方程，可见米氏方程式与试验结果是相符的。

设，代入式（5-8），则可得：

由式（5-14）说明，ES的解离常数K_s，即当反应的初速度v为最大反应速度v_m的1/2时所需的底物浓度，故K_s的单位可以用物质的量（mol/L）浓度单位表示。

K_s的倒数1/K_s=K₁/K_-1为亲和常数，可代表E和S形成中间复合物E S的亲和力，K_s很小或1/K_s很大，说明ES不易解离成（E+S），而E和S都很容易形成ES，只要很少的[S]便可使v达到最大反应速度的1/2。

所谓[S]的极小或极大值，实际上可看作K_s和[S]的相对比值。如K_s和[S]相比要大得多，则式（5-8）分母中的[S]可忽略不计，则：

此式说明反应对底物为一级反应，其速度与[S]成正比，反之，当K_s和[S]相比小得多，则式（5-8）分母的K_s可忽略而成为：

此式，反应速度达到最大的恒定值，反应速度与底物浓度无关，该化学反应属零级反应。

1925年Brigg-Haldane认为，快速平衡假定中K₀不能远小于K_-1。因此，他们提出了一个恒态（Steady-State）学说并对米氏常数的推导加以修正。该学说在公式推导时，保留了米氏的前两点假定，而将第三点假定修改为恒态假定，其恒态假定如图5-2所示。

图5-2 恒态假定示意图

根据B-H两氏的恒态学说，其反应式为：

生成ES的速度为

ES消失的速度为

当该反应处于恒态时，ES生成和消失的速度相等。

因为

则

Brigg和Haldane将的复合常数以K_m为代表，K_m即为米氏常数（Michaelis constant），因此：(www.chuimin.cn)

同样可用，代入式（5-24），则：

此式与式（5-8）一样，区别在于用K_m取代K_s，为了纪念Michaelis和Menten两人，两式均称为米氏方程式，均为双曲线动力学图形。但K_m不同于K_s，因为K_m还取决于K₀的大小。

如果当K₀＞K_-1时，K_m也大于K_s，其差值为K₀/K₁，此时1/K_m就大于E和S的亲和常数。

，如果K₀远小于K_-1，

则

米氏常数K_m的含义：K_m是酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。其数值为一个常数，但可在严格规定条件下测定，通常以mo l/L表示。实质上K_m是酶与底物亲和力的量度，K_m值大表明K₁小，E和S的亲和力小。反之，K_m值小表明K₁大，E和S的亲和力大。一些酶的K_m如表5-1所示。

表5-1 一些酶的K_m值

K _m及v_m可以根据两组不同底物浓度的试验数据代入公式，然后解二元一次联立方程式计算。但此法不够简便，而且因v不易准确测定，故K_m不易准确计算。

1934年Lineweaver和Burk提出双倒数法作图求取K_m。将米氏方程式两边变为倒数，即为：

这个公式相当于y=ax+b，是一个直线方程式，其斜率为，截距为，直线与轴的交点等于。因为时，，如图5-3（1）所示。

例如，酵母菌脱羧酶的反应，经过实验求得表5-2所列的数据。根据这个实验就可用方格纸以作图，如图5-3（2）所示。并求出该酶的K_m及v_m。

图5-3 作图法

表5-2 酵母菌脱羧酶反应速度

由于

故

1959年Eadie-Hofstee提出第二种作图法，将米氏方程移项整理后可得：

故

此式为一个直线方程式，作图结果如图5-4所示。

当时，截距为v_m。

，当时，截距为。

1974年Eisenthal和Cornish-Bowden提出第三种作图法。

在一定酶浓度时，米氏方程双倒数关系可以整理为式（5-31）

即：

当v_m对K_m作图，可以得到一条直线，如图5-5所示。当K_m=0，v=V_m，当v_m=0，K_m=-[S]

图5-4 Eadie-Hofstee作图法

图5-5 Eisenthal和Cornish-Bowden作图法

上述三种作图法求取K_m在研究和实际工作中均有所应用。由于第一种作图法比较简便，较为普遍采用，其缺点是若[S]浓度低时，与v所成的点所占的分量较重，易造成一些不够精确的v_m值和K_m值，而后两种作图法不存在此问题。