食品酶学导论：酶反应速度测定方法

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：酶促反应速度和普通化学反应一样，可用单位时间内底物减少量或产物增加量来表示。反应速度即图中曲线的斜率。酶反应速度，是对初速度而言。在一定条件下，酶所催化的反应速度称为酶活力。由于反应底物或产物可显示不同吸收光谱，光吸收与浓度成正比，光吸收改变的速率与酶活力也成正比，因而可用分光光度计来进行测定酶反应的情况。

酶促反应速度和普通化学反应一样，可用单位时间内底物减少量或产物增加量来表示。一般采用测定产物在单位时间的增加量来表示的较多，因为测定起来比较灵敏，可制作出产物浓度与时间关系曲线（图5-1）。反应速度即图中曲线的斜率。酶催化反应仅在最初一段时间内其产物与时间成比例关系，随着时间的延长，反应速度即逐渐降低。因为随着反应的进行，底物浓度降低，产物浓度增加，从而加速了逆反应的进行。另外产物对酶的抑制作用、pH和温度等因素的影响使酶逐渐失活。所以，为准确表示酶活力，就必须采用如图5-1中的直线部分，即用初速度来表示。酶反应速度，是对初速度而言。一般所用底物浓度至少要比酶的K_m值大5倍以上。酶反应速度越大，酶催化活力越高。

图5-1 酶反应速度曲线

由于大多数酶制剂在贮存过程中其生物活性也会受外界环境影响而逐渐失活，同时，有些酶的分子结构和分子质量还没确定，因此，难以对酶量进行准确表示，既不采用重量单位，又暂不能采用物质的量浓度表示，而是采用酶的活力单位（active unit）表示。

在一定条件下，酶所催化的反应速度称为酶活力。即一定时间内底物分解量或产物生成量，用单位数表示。1961年国际生化协会规定：在特定条件下（温度25℃，其他条件如pH及底物浓度均采用最适宜的），每分钟催化1μmol的底物转化为产物所需要酶量称为1个单位（U），称国际单位（IU）。

酶的比活力是指在固定条件下，每毫克酶蛋白（或RNA）所具有的酶活力。

比活力=酶活力/毫克酶蛋白（或RNA）

对液体状态酶活力常以U/mL（酶液）表示，酶的比活力是酶纯度的一个指标。

国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（kat）。在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特。

1kat=1mol/s=60mol/min=60×10⁶μmol/min=6×10⁷IU

由于酶促反应受许多条件的影响，因此，在测定酶活力时要使反应条件恒定，对于温度和氢离子浓度需要严格控制。

温度对酶反应的影响较一般化学反应更为灵敏，酶本身也容易受热破坏。所以，在测定酶反应时必须使温度保持恒定，一般采用恒温容器（如恒温水槽）。

测定时pH也必须保持一定，通常在溶液中加入缓冲溶液。同时，还应注意避免混入任何微量杂质。

测定酶活力常用的方法有如下几种。

1.化学分析法(www.chuimin.cn)

化学分析法是采用一般化学容量测定的方法，定量地测定反应产物（如酸、碱、无机磷、氨基酸和还原糖等）来测定酶活力。此法设备简单，无需特殊仪器，应用较广。

2.分光光度测定法

分光光度测定法是酶学研究常用的方法。酶反应中的底物或产物往往含有不饱和的或环状的原子团，如等。它们在光谱可见光区、紫外光区或红外光区均具有吸光性。由于反应底物或产物可显示不同吸收光谱，光吸收与浓度成正比，光吸收改变的速率与酶活力也成正比，因而可用分光光度计来进行测定酶反应的情况。此法特点是迅速、简便、灵敏和专一性强，而且不必终止反应。