酶是在活细胞中合成并在胞内或胞外介质中存在的。胞内酶在细胞内存在部位和结合状态比较复杂，因而抽提难度较大。酶的抽提目的是将尽可能多的酶或尽可能少的杂质从原料组织和细胞中引入溶液，以利于酶的纯化。但此法用于酶的大量提取有一定局限性。经丙酮处理的细胞干粉称为丙酮粉。丙酮还能除去细胞膜部分脂肪，更有利于酶的提取。根据酶在细胞内结合状态以及其溶解程度，酶的抽提可分为水溶法和有机溶剂法两种。......
2023-11-22
第五节模拟酶-食品酶学导论
【摘要】：科学家们对利用简单分子模型构建酶的特征进行了研究，为人工模拟酶的发展提供了理论依据。模拟酶又称人工酶或合成酶。经过数十年的努力，分子印迹技术趋于成熟，并在分离提纯、免疫分析、生物传感，特别是人工模拟酶等方面显示出广阔应用前景。在胶束模拟酶中常用氧肟酸代替羟基酸来研究氧负离子的亲核反应。人工模拟酶的研究属于化学、生物化学与生物物理等领域的交叉学科。
20世纪70年代以来，由于光谱、X-射线衍射技术和蛋白质结晶学的发展，对酶结构及其作用机理能在分子水平上进行解释。科学家们对利用简单分子模型构建酶的特征进行了研究，为人工模拟酶的发展提供了理论依据。
模拟酶又称人工酶或合成酶。近年来，人们对小分子仿酶体系、抗体酶、半合成酶、分子印迹酶模型和胶束模型等人工酶进行了系统研究，已经取得了可喜的进展。
（1）酶作为催化剂首先与底物结合，进而选择性稳定在某一特定反应的过渡态（TS），降低反应的活化能，从而加快反应速度。设计模拟酶一方面要依据酶的催化机制，另一方面则基于对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究。通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应活化能。
（2）根据法国著名科学家Lehn提出的超分子化学（supermolecular chemistry）概念和Pederson的光学活性冠醚的合成方法，认为超分子的形成来自底物和受体的结合。主-客体化学的本质也来自酶与底物的相互作用。这种作用基于非共价键作用，如静电作用、氢键和范德华力等的作用，为人工模拟酶的设计提供了重要理论基础。
1992年Breslow R等对环糊精模拟酶合成的研究认为，模拟酶增加催化效率的关键是要增加环糊精对底物过渡态的结合能力。其最简单的方法是修饰底物，以增加底物与环糊精（CD）的结合。
1972年Wulff研究小组首先报道了聚合物的制备。经过数十年的努力，分子印迹技术趋于成熟，并在分离提纯、免疫分析、生物传感，特别是人工模拟酶等方面显示出广阔应用前景。
分子印迹（molecular imprinting）是指制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物称为印迹分子（print molecule，P）或称为模板分子（template molecule，T）。分子印迹也称为主-客聚合作用或模板聚合作用，如图4-28所示。
印迹聚合物形成的条件为：①底物结构和互补性、分子结构、大小要相似，否则影响分辨力；②聚合物与印迹分子间作用力，如两者间能够产生多种相互作用力，则会大大改善聚合物的识别能力；③对交联剂类型和用量具有选择性，一般采用80%以上的交联度为宜；④低温聚合可以稳定印迹分子和单体间的复合物；⑤溶剂的选择也是十分重要的，最好的溶剂应选择低介电常数的溶剂（如甲苯和二氯甲烷等）。(www.chuimin.cn)
在人工酶的研究中，印迹被证明是产生酶结合部位的最好方法。其关键是如何利用此技术来模拟复杂的酶活性部位，使其与天然酶相似。多年来，在水相酶和非水相酶的制备开展了大量研究，取得许多重要的研究成果。1984年Keyes等报道了首例用这种方法制备的印迹酶，选择吲哚丙酸为印迹分子。印迹牛胰核糖核酸酶，粗酶经硫酸铵（70%～90%）纯化后，酯水解比活力增至22U/g。非水相生物印迹可以改变酶结合部位的特异性。Dordick最近利用生物印迹方法改造枯草杆菌蛋白酶，并成功地制备出活力较高的核苷酸酰基化酶。
图4-28 分子印迹原理图
P-印迹分子
胶束模拟酶不仅涉及简单的胶束体系，而且对功能化胶束、混合胶束、聚合物胶束等体系也进行了较深入的研究。在胶束模拟酶中常用氧肟酸代替羟基酸来研究氧负离子的亲核反应。它们催化对硝基苯酚乙酸酯（PNPA）在胶束中的水解反应，其速度常数比在非胶束中提高近万倍。如用氧肟酸与十六烷基三甲基铵溴化物（CTAB）一起催化酮醇去质子反应，其催化速度提高3000～20000倍，是OH-催化反应的60～300倍。
胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物束缚。如果将催化基团如咪唑、硫醇、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接或吸附在胶束上，便可能提供活性部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酶。组氨酸的咪唑基是一种水解酶活性部位的催化部位。如将表面活性剂分子上连接组氨酸残基或咪唑基团上，即有可能形成模拟水解酶的胶束。
维生素B6是色氨酸合成酶的辅酶，这种合成酶催化丝氨酸和吲哚反应转化为色氨酸。将疏水性维生素B6长链衍生物与阳离子胶束混合形成的泡囊体系中，在Cu2 +存在下可将酮酸转化为氨基酸，可有效地模拟维生素B6为辅酶的转氨作用。
人工模拟酶的研究属于化学、生物化学与生物物理等领域的交叉学科。它对生物体系反应的模拟、设计及制备进而开发出比自然界更为优越的催化体系，将为食品、医药、环境、化工等领域应用开辟更广阔的前景。
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2023-11-22
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