茎顶端分生组织发育的分子机制-植物发育生物学的新发现

茎顶端分生组织几个区域的特性分别由几个关键基因决定，光、生长素和细胞分裂素等激素通过多种途径调控这些关键基因，细胞内各种表观遗传调控以及各种表达水平的调控协同作用，共同修饰调节顶端生长。

茎顶端分生组织中心区域未分化细胞的标志基因WUSCHEL（WUS）基因（图9.1）能抑制干细胞的分化，从而保持分生细胞在一定的数量水平。拟南芥wus突变体丧失维持茎尖分生组织细胞数量的功能，形成一个形态异常、功能缺失的茎尖分生组织。茎尖分生组织分化少许的几片叶子以后，因为分生细胞耗尽而停止了生长（Laux，1996）。WUS在胚发育早期在生长素分布的浓度较低区域表达。在早期到晚期球形胚和心形胚以及愈伤组织诱导的前胚上，生长素运出载体PIN1与WUS共表达。当子叶分开，茎顶端分生组织形成时，只有WUS分布在表皮下分生组织中心区域。生长素与WUS的共表达说明生长素可能对WUS的表达起诱导作用。

WUS的分布范围通过CLV3和CLV3类似的CLE信号肽与识别它们的几个不同的细胞膜上的受体激酶复合体CLV1/CLV1复合体、CLV2/CRN复合体以及BAM等的协同调控，对WUS的表达范围进行抑制或促进，使WUS限制在中心区域，保持一定的干细胞数目。WUS与CLV系统的反馈调控环是控制茎尖分生组织正常功能的重要调控手段。

茎顶端分生组织中生长素水平见光后急剧下降，细胞分裂素活性上升（López-Juez et al.，2008）。细胞分裂素受体AHK2和AHK4在茎和花顶端分生组织介导细胞分裂素作用，AHK2介导不依赖CLV的途径诱导WUS的表达，而AHK4介导依赖CLV的途径诱导WUS的表达。细胞分裂素诱导A类和B类ARR的表达，A类ARR5被AHK在ASP区域磷酸化，可能通过这种磷酸化作用负调控细胞分裂素的信号传导，ARR5也抑制WUS的表达。WUS反过来抑制ARR5的活性，激活CLV3的表达，高水平细胞分裂素抑制CLV1的表达，而CLV3和CLV1形成复合体抑制WUS的表达。细胞分裂素通过AHK4抑制CLV1的表达降低CLV1/CLV3复合体对WUS的抑制，促进WUS的表达（Gordon et al.，2009）。

WUS与CLV3的转录水平也受到表观遗传修饰的调控。Yue等（2013）发现拟南芥skb1突变体通过H4R3me2-组蛋白H4上第3位精氨酸双甲基化修饰，调控可以与CLV1形成异源复合体的CRN蛋白的表达，skb1中WUS和CLV3的表达也同时降低，造成SAM宽度降低的表型。

Schuster等（2014）从拟南芥中分离到bHLH类转录因子HEC基因家族，包括HEC1、HEC2、HEC3三个基因。HEC1处于WUS-CLV3反馈环上游，以背景特异方式抑制WUS和CLV3的表达，三突变体的SAM显著变小，HEC基因与SPT（bHLH类转录因子）存在体内互作，转录组分析表明HEC基因还调控与细胞分裂素反馈调控相关的ARR7、ARR15等基因的表达。

microRNA通过对WUS和CLV3等基因的转录和翻译抑制影响SAM的发育，例如由AGO1复合体和miR165/166通过负调控HD-ZIPⅢ，影响WUS-CLV3信号途径和SAM干细胞的维持（Tucker et al.，2013）。ZLL/AGO10与AGO1具有相拮抗的关系。SQN（SQUINT）基因编码拟南芥Cyclophilin-40类似蛋白，修饰ZLL/AGO10，属于FLETSCHE（FHE）1～5五个位点中的FHE2，它们的序列和表达在拟南芥不同的生态型种中发生变异，最终影响WUS-CLV3（Tucker et al.，2013）。

Knauer等人（2013）在拟南芥中通过正向遗传学分离到enh146突变体，鉴定为miR394的错义突变。enh146 ago10双突变体造成98%的植株缺失SAM，由于错义突变，miR394不能负调控靶基因LCR（leaf curling responsiveness）。LCR为F box蛋白，与26S蛋白酶体介导的蛋白质降解有密切关系，抑制WUS-CLV3信号途径。miR394通过RNAi方式下调SAM远端细胞层中LCR蛋白的表达水平，从而影响SAM中细胞信号途径和分化的发生。

茎顶端分生组织的另一个必需基因是Shoot meristemless（STM）。STM编码含有MEINOX三个氨基酸环的HD转录因子，其MEINOX区域与BLH（Bel1-like homeodomain）类型的转录因子中的BELL区域结合，形成异源聚合体，这种结合对于它们进入细胞核是必需的。STM属于KNOX基因家族中的类型I基因，KNOX I类基因具有促进细胞分裂和延长的特性（Lenhard et al.，2002；Douglas et al.，2002）。不同的KNOX基因在不同的部位与不同的因子相互作用，被限制在特定区域表达，促进相应部位的细胞分裂和器官发育。拟南芥KNAT1（又称BP，BREVIPEDICELLUS）、2、6、STM（Shoot meristemless）是KNOX I类基因，在茎顶端分生组织表达。玉米的（KNOTTED1）KN1与拟南芥KNAT1和STM最相似，与KNAT1在结构上相似，在功能上与STM相似。玉米的KN1基因是第一个克隆出来的同源盒基因，以后类似KNOTTED的基因（KNOTTED1-like homeobox）称为KNOX基因。拟南芥KNAT3、KNAT4、KNAT5、KNAT7是Ⅱ类KNOX基因。

STM在茎顶端分生组织中心区域和周围区域表达，不同部位表达量受到相应区域各种不同因子的控制。STM诱导催化细胞分裂素CK合成有关酶的基因IPT7（isopentyltransferase）、细胞分裂周期蛋白CYCB1；1、CYCD3、边界基因CUC1、CUC2、CUC3、降解CUC的miR164a、降解赤霉素的GA2ox1等基因的表达，降低合成赤霉素的GA20ox1的表达，提供一个高细胞分裂、低细胞分化的环境（Spinelli et al.，2011）。STM还诱导KNAT1和KNAT2的表达，抑制侧生器官发育促进因子AS1（ASYMMETRIC LEAVES1）的表达（Lenhard et al.，2002）。细胞周期调控蛋白CYCD3激活周期蛋白依赖的激酶cyclin-dependent kinases（CDKs），通过RETINOBLASTOMA RELATED（RBR）蛋白的磷酸化直接进入S期，促进细胞的有丝分裂，同时抑制细胞内复制和分化。CYCB1；1促进细胞由G2进入M期，从而促进细胞分裂。CK也促进CYCD3、KNOX等基因的表达（图9.6）。同属于KNOX家族蛋白的KNAT1/BP，KNAT2在抑制细胞分化和维持干细胞数量上与STM有类似的功能，但是对于CK的需求有所不同（Scofield et al.，2013）。相比之下，WUS虽然诱导干细胞特性，但不诱导KNAT1、KNAT2的表达和细胞分裂。STM和KNAT1/BP具有不依赖高水平CK、CYCD3、WUS活性，直接诱导SAM的从头形成，KNAT2无此作用。STM和WUS共同维持干细胞分生区的特性（Lenhard et al.，2002）。

KNAT6在茎顶端分生组织的周围区域表达，在胚发育中表达时期晚于STM，与STM作用重叠，共同保持分生组织特性。KNAT2不具有这个作用（Belles-Boix et al.，2006）。KNAT1和PNY（PENNYWISE，KNOX类基因）在花序顶端分生组织限制KNAT6和KNAT2的表达，保证花序形态的正常（Ragni et al.，2008）。茎顶端分生组织中KNAT1可能具有相似的作用。STM和KNAT1的作用部分重叠（Souček et al.，2007）。BELL转录因子BHL3和BHL9在SAM特定位点表达并可与STM结合，因此赋予STM不同的功能（Aida et al.，1999；Cole et al.，2006）(www.chuimin.cn)

SEU和SLK处于包括STM、BP/KNAT1、KNAT2等KNOX I基因的上游，通过对这些基因的调控影响生长素在SAM的分布和形态建成。seu slk2双突变体缺失SAM，子叶既小且窄，STM、BP、KNAT2、KNAT6等KNOX I基因表达均比野生型有显著下降（图9.6）（Lee et al.，2014）。

拟南芥KNAT1、KNAT2在茎顶端分生组织普遍表达，生长素类对KNAT1在茎顶端分生组织的表达没有明显影响，细胞分裂素和光扩大KNAT1在茎顶端分生组织的表达范围（Souček et al.，2007）。KNAT基因的表达也受到其他上游基因的调控，并且影响赤霉素在顶端分生组织的分布。玉米半显性突变extra cell layers1（xcl1）导致茎顶端分生组织多层表皮细胞形成，更多细胞加入叶原基的形成，茎顶端分生组织区域减小，KN1活性受到部分抑制，参与赤霉素降解的GA2ox表达提高，而参与赤霉素合成的GA20ox没有明显变化（Kessler et al.，2006）。烟草中KNOX基因Nicotiana tabacum homeobox 15（NTH15）在SAM顶端分生组织的原生分生区域抑制赤霉素合成酶基因GA20ox的表达，保持原分生组织的未分化状态（Sakamoto et al.，2001）。

图9.6　茎顶端分生组织基因调控网络示意图（严海燕绘）

L1层的细胞分裂类型影响茎顶端分生组织的保持。玉米野生型KN1在茎的皮层表达并运输到表皮，在SCR启动子控制下分布在L1、L2、L3层（Kim JY.et al.，2002），拟南芥KNAT1、KNAT2、STM蛋白也可以从茎顶端分生组织内部向L1进行单向细胞间移动（Kim JY.et al.，2003）。KNOX同源盒区域的功能足以完成KNOX蛋白质和mRNA的细胞间移动功能（Kim JY.et al.，2005）。

在茎顶端分生组织的周围区域，拟南芥YABBY类蛋白FILAMENTOUS FLOWER（FIL）和YAB3决定侧生器官远轴特性，这两个蛋白的突变引起侧生器官中KNOX类基因STM、KNAT1、KNAT2的去抑制，同时部分恢复stm突变体的表型（Kumaran et al.，2002）。ANT（AINTEGUMENTA）与FIL和YAB3启动子结合，三突变或双突变叶和花极性异常，叶和植株个体减小（Nole-Wilson and Krizek，2006）。FIL和YAB3与LEU（LEUNIG）、LUH（LEUNIG-HOMOLOG）、SEUSS和SEUSS相关蛋白形成复合体，对胚性茎顶端分生组织的起始、胚后茎顶端分生组织的保持、叶子的近轴和远轴特性都起着重要作用（Stahle et al.，2009）。转录因子KANADI和YABBY共同控制叶片远轴特性。KANADI类的KAN1、KAN2、KAN3在器官发生中具有重叠作用，共同决定远轴特性，抑制HD ZIPⅢ类的PHABULOSA（PHB）、PHAVOLUTA（PHV）、REVOLUTA（REV）的近轴功能（Eshed et al.，2004）。HD ZIPⅢ类基因PHB、PHV、REV、CORONA（CNA）和远轴转录因子KAN在发育的胚中都通过影响PIN1的分布，影响生长素反应。kan1、kan2、kan3突变体PIN1在侧向有额外分布，导致侧生原基形成（图9.7），植株形态异常（Izhaki and Bowman，2007）。一类小ZIP蛋白ZPR3＼ZPR4与PHB等HD ZIPⅢ类蛋白在ZIP区域结合，形成异源聚合体，负调控HD ZIPⅢ类的活性，zpr3-2 zpr4-2双突变体分生组织活性改变，干细胞保持异常。PHB正调控ZPR3的表达（Kim Y.et al.，2008）。

图9.7　近轴和远轴类基因对PIN1表达分布的影响（Izhaki and Bowman，2007，ⓒASPB）（严海燕修饰）

一批边界基因在茎顶端分生组织与子叶或侧生原基的分离中与STM等基因一起发挥重要作用。CUP-SHAPED COTYLEDON（CUC）三个同源类似基因具有重叠作用，在茎顶端分生组织与子叶和侧生原基的边界分离中，共同保持分生组织的结构和子叶的分离（Aida et al.，1999；Vroemen et al.，2003；Belles-Boix et al.，2006）。cuc1和cuc2的双突变子叶完全融合，呈杯状（图9.8）。PIN1和MP表达影响CUC1和CUC2的表达分布，pin1mp双突变体CUC1表达范围扩大，CUC2表达范围缩小，表明PIN1和MP在外侧抑制CUC1的表达，在内侧促进CUC2的表达（Aida et al.，2002）。在胚发生早期的球形胚和心形胚阶段，CUC2的表达区域与STM的表达区域在L1层下的区域重叠（图9.9，Aida et al.，1999），CUC1和CUC2的表达对STM的表达是必需的，双突变体胚中STM不表达。STM表达后抑制CUC2的表达。当有活性的STM发挥功能时，CUC2在STM活跃区域下调表达，只剩在STM不表达的周围区域表达，这时进入鱼雷期，子叶分开，与顶端分生组织形成边界，CUC在此区域表达（图9.9，Aida et al.，1999；Vroemen et al.，2003）。TCP类基因在SAM和叶边缘限制CUC的分布范围（参见第一章）。