植物组培快繁的关键是植物在组织培养中再分化器官发生类型，也是组织培养中间繁殖体增殖的类型。植物组织培养中间繁殖体的类型是多种多样的，再生方式也不统一，其类型关系到繁殖速度和繁殖数量。美国红栌、叶子花、樱桃砧木等木本植物通过这种器官发生类型进行组培快繁，速度快。杨树、半夏、海棠、菊花等植物的快繁都可以通过这种器官发生类型增殖。图5-2-4原球茎发生型图5-2-5植物组织培养再分化植株的类型与繁殖途径......
2023-11-20
植物组织培养快繁技术：单细胞培养及无性系获得
【摘要】：培养基和愈伤组织供给单细胞营养，使细胞能持续分裂形成细胞团。一般1个多月后，单细胞可分裂成为肉眼可见的愈伤组织小块，待2～3个月后即可从滤纸上直接转移到新鲜培养基上，得到单细胞无性系。平板培养是为分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术，广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。由于培养基少，营养、水分和pH变动大，培养细胞仅能短期分裂。
（一）看护培养法
指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。此法简单易行，易于成功，但不能在显微镜下直接观察细胞生长过程。
具体方法是：
1.把含琼脂的培养液加到小三角瓶中，使成1 cm厚，高压灭菌后备用。
2.在无菌条件下，取处于活跃生长期的约1 cm见方的愈伤组织块，将其安放在三角瓶中固体培养基上的中央部位，并在愈伤组织块上放一片约1 cm2的无菌滤纸，将其在培养室中放置过夜，使滤纸充分吸收从组织块渗出来的营养成分。
图8-1-1 看护培养法的培养过程
3.将分离出的单个细胞接种到滤纸上进行培养。
培养基和愈伤组织供给单细胞营养，使细胞能持续分裂形成细胞团。一般1个多月后，单细胞可分裂成为肉眼可见的愈伤组织小块，待2～3个月后即可从滤纸上直接转移到新鲜培养基上，得到单细胞无性系。
（二）平板培养法
指将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层（1 mm）在培养皿底上进行培养的方法。平板培养是为分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术，广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。
1.单细胞悬浮液的制备
将要培养的材料诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织或器官组织用酶解法或机械振荡培养法游离出单细胞，然后用孔径大小适当的不锈镍丝网过滤，除去残渣和多细胞团，滤液即为细胞悬浮液。
图8-1-2 平板培养法
2.悬浮细胞密度的调制
平板培养要求一定的细胞密度，过高过低都对培养不利。因此，必须对过滤得到的悬浮液进行细胞计数。操作方法如下：
（1）滴一滴悬浮细胞液到计数板凹槽中。
（2）盖上盖玻片，稍压使之与计数板紧密结合。若凹槽中有气泡，应重新制作。(www.chuimin.cn)
（3）置于显微镜下经重复多次观察，记下视野中计数板上方格内的细胞数。
（4）换算成每毫升中的细胞数。
由于每个方格的体积是已知的，可根据已知方格中的细胞数换算出每毫升悬浮液中的细胞数，然后根据平板培养要求的细胞密度和悬浮液的实际密度进行调制。一般的平板培养要求细胞密度每毫升1×103～1×105个，若悬浮液同琼脂培养基以1：2或1：4混合，则应把悬浮液的细胞密度调到每毫升2×103～2×105个或者5×103～5×105个。若悬浮液中细胞密度高于此值，则加培养液稀释；若低于此值，则通过离心使细胞下沉后，吸出一定量上清液使其达到所要求的密度。
3.琼脂培养基的配制
有两种配制方法，一是直接配制1.4%琼脂培养基；二是配制条件培养基，其制作方法是，首先把已进行一段时间亲本细胞培养的液体培养基离心，沉淀细胞材料，取上清液一份同灭菌的1.4%琼脂培养基一份趁热充分混合，即为含0.7%琼脂的条件培养基。
4.平板制作
取上述已知细胞密度的单细胞悬浮液一份，与溶化状态的（35℃）0.7%琼脂条件培养基2～4份充分混合均匀，倒入各个无菌培养皿中，制成1 mm厚的琼脂培养基平板，盖上皿盖，并用胶带封口。
5.培养
将平板置于25℃的条件下培养，定期观察，大约3周后即形成单细胞无性系。再计算每个培养皿中出现细胞团的数量，由此计算植板率。植板率是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分比（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。
植板率=（每个平板中所形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数）×100%
（三）微室培养法
指人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。该方法可在暗视野或相差显微镜下清楚地观察到活细胞的各种变化，甚至还可以观察到线粒体的变化。由于培养基少，营养、水分和pH变动大，培养细胞仅能短期分裂。其培养方法是：
图8-1-3 微室培养法
1.将洗净的盖玻片与载玻片在酒精灯火焰上消毒，冷却后按盖玻片大小在载玻片上涂一圈四环素眼膏，形成一个凹穴。也可用石蜡油与盖玻片组建凹穴。
2.将细胞悬浮液滴一小滴于凹穴内，然后在四环素眼膏上放一小段毛细管，将消毒后的盖玻片盖在四环素眼膏围成的凹穴上，使其与眼膏紧密接触，这样在盖玻片与载玻片之间形成一密闭的小室，小室通过毛细管与外界通气，盖玻片盖上后要使其与细胞悬浮液滴相接触。
3.带有培养物的微室可以按需要放在培养箱或培养室中，温度26℃～28℃，光照或黑暗条件下进行培养。
4.观察或照相时的环境温度一定要与培养时的温度相同。
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2023-11-20
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2023-11-20
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2023-11-20
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