植物组织培养快繁技术：从植物组织中快速分离单细胞

2023-11-20 理论教育版权反馈

【摘要】：在细胞培养中，既可以从植物器官、组织中分离单细胞，也可以从愈伤组织中分离单细胞。用孔径200 μm的细胞筛过滤，除去大块细胞团，再以4000 r/min速度离心，除去比单细胞小的残渣碎片，获得纯净的单细胞悬浮液。

在细胞培养中，既可以从植物器官、组织中分离单细胞，也可以从愈伤组织中分离单细胞。常用的分离方法有如下几种。

叶组织是分离单细胞的最好材料。目前最常用的方法是先把叶片轻轻研碎，然后通过过滤和离心把细胞净化。具体做法是：

（1）称取10 g新鲜叶片，进行表面清洗消毒后，放入研钵中。

（2）加入40 mL研磨介质（20 μmol/L蔗糖+10 μmol/L MgCl2+20 μmol/L Tris-HCl缓冲液）轻轻研磨成匀浆。

（3）将匀浆用双层细纱布过滤。

（4）滤液经过低速离心，其中细微的碎屑会被除掉，游离细胞就会沉降到试管底部，得到纯化细胞。

2.酶解法

利用果胶酶、纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞，这种方法不仅能降解中胶层，还能软化细胞壁。所以用酶解法分离细胞时，必须对细胞给予渗透压保护。具体做法是：

（1）制备果胶酶。0.5%果胶酶+0.5%葡聚糖硫酸钾+0.8%甘露醇，配成20 mL，调节pH为5.8，用孔径为0.2～0.4 μm的滤膜过滤灭菌。(www.chuimin.cn)

（2）取刚长出的嫩叶用70%乙醇漂洗数秒，用饱和漂白粉上清液浸泡15 min，无菌水冲洗4～5次。吸干表面的水分，用消过毒的镊子撕去叶的下表皮。

（3）用消过毒的解剖刀将叶片切成3 cm见方的小块，取2 g切好的叶片放入装有果胶酶液的三角瓶中。

（4）用真空泵抽气1～2 min，使酶渗入细胞间隙。

（5）将三角瓶置于低速转床上，转速为120 r/min，温度25℃～28℃，30 min后，吸去酶液及碎片。

（6）放入上述果胶酶20 mL，保温振荡30 min，吸取酶液，此酶液主要含有海绵组织细胞。

（7）再次放入上述果胶酶20 mL，保温振荡30 min，用纱布或尼龙网过滤除去被消化的叶脉和表皮。

（8）在100 g（g为重力加速度）条件下离心2 min，吸去上清液，底层即得均一的栅栏组织单细胞。

3.由愈伤组织分离单细胞

将未分化、易碎散的愈伤组织转移到装有适当液体培养基的三角瓶中，然后将三角瓶置于水平摇床以80～100 r/min速度振荡培养，获得悬浮细胞液。用孔径200 μm的细胞筛过滤，除去大块细胞团，再以4000 r/min速度离心，除去比单细胞小的残渣碎片，获得纯净的单细胞悬浮液。