植物组织培养快繁技术：胚培养、营养需求与生长条件

2023-11-20 理论教育版权反馈

【摘要】：胚生长依赖胚乳、子叶贮藏的营养，对培养基的要求简单，只要提供合适的生长条件以及打破休眠，即可萌发成幼苗。幼胚培养的方法与成熟胚培养基本相同。成熟胚在低浓度（含2%）蔗糖的培养基中生长很好，但幼胚要求较高水平的碳水化合物。未成熟胚加入蔗糖最重要的作用是保持培养基适当的渗透压。如在20℃下马铃薯胚培养较好。光对胚胎发育有抑制作用，一般黑暗或弱光下利于幼胚培养。

（一）胚培养类型

植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育为成熟胚。根据胚胎的成熟度可将胚培养分为两类：成熟胚培养与幼胚培养。

1.成熟胚培养

成熟胚培养是指子叶期后发育完全的胚在含有无机大量元素和糖的培养基上正常生成幼苗的过程。成熟胚一般在比较简单的培养基上就能萌发、生长、成熟。胚生长依赖胚乳、子叶贮藏的营养，对培养基的要求简单，只要提供合适的生长条件以及打破休眠，即可萌发成幼苗。

2.幼胚培养

幼胚培养是指对子叶期前尚未成熟（发育早期）的胚的离体培养。幼胚培养比成熟胚培养困难，要求的技术和条件较高。幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的价值，因此其研究和利用越来越深入和广泛。

（二）胚培养方法

1.成熟胚培养

成熟胚培养较易成功。带有种皮的成熟或未成熟种子，由于有较厚的种皮包裹，所以不易损伤，易于消毒灭菌。用75%酒精进行几秒钟的表面消毒，再用无菌水冲洗3～4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上常规条件下培养，胚即可发育成完整的植株。

2.幼胚培养

远缘杂交中离体胚的培养主要是幼胚培养，幼胚培养技术在育种中更为重要。

幼胚离体培养中，培养的胚胎维持正常的胚性生长，是胚培养的关键。幼胚（未成熟胚）一般不能像成熟胚一样在简单培养基上生长，它们比成熟胚对营养的需求更为复杂，为了使不能产生杂种的远缘杂交获得杂种，需要改良培养基，使离体幼胚能沿着胚珠内胚胎发生的途径发育（维持胚性生长）。

胚培养研究最多的是荠菜和大麦这两种被子植物，此外，在曼陀罗属、柑橘属和菜豆属中也进行了大量研究工作。

幼胚培养的方法与成熟胚培养基本相同。应该注意的是切取幼胚时，必须在高倍镜下进行，操作时要特别小心，尽量取出完整的胚。在未成熟胚胎的培养中，幼胚离体培养的生长情况通常有三种。

（1）胚性发育：继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，形成成熟胚（类似种子），再按种子萌发途径出苗，形成完整植株（一个胚只形成一个植株）。

（2）早熟萌发：培养后迅速萌发为幼苗，不继续进行胚性生长，越过正常胚发育阶段，在未达到生理和形态成熟的情况下，萌发长成幼苗。早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至会死亡。

（3）形成愈伤组织：多数情况下，幼胚在离体培养中首先细胞分裂形成愈伤组织，再分化形成多个胚状体或芽原基，最后发育成植株。胚性愈伤组织易形成植株。

胚胎发育过程分为两个时期（根据胚对营养的需求）：

（1）异养期（heterotrophy period），即在胚发育早期，幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。

（2）自养期（autotrophy period），胚已经能在基本的无机盐和蔗糖的合成培养基上生长，在营养上已相当独立。

幼胚培养不同时期对培养基的要求不一样，异养期培养基成分复杂，自养期则相对简单。

（三）影响胚培养的因素

1.培养基

成熟胚的培养基较简单，主要有Turkey、Randolph、White等，以大量元素和微量元素的无机盐为基本成分。

幼胚培养的培养基常用的有MS、B5、Nitsch以及Rijven、Rangaswang、Norstog等。

Monnier在研究无机盐对荠菜胚培养的影响中发现：Knop、Miller培养基中，幼胚存活率较高、生长较差；MS培养基中，幼胚生长好、存活率低；调整无机盐成分（K、Ca浓度增高，浓度降低），存活率高、生长较好。

2.糖

糖在胚培养中具有三个方面的作用，即调节培养基的渗透压、作为碳源和能源、防止幼胚的早熟萌发。(www.chuimin.cn)

成熟胚在低浓度（含2%）蔗糖的培养基中生长很好，但幼胚要求较高水平的碳水化合物。

未成熟胚加入蔗糖最重要的作用是保持培养基适当的渗透压。如果蔗糖浓度过低，易引起胚胎早熟萌发。

3.激素

不同植物的胚胎培养所需的激素不同。一般认为，IAA可使胚的长度增加，加入6-BA可提高胚的生存机会。诱导愈伤组织时，加生长素、细胞分裂素；胚胎发育时，不加生长素、细胞分裂素。GA3、KT促进早熟萌发，ABA抑制早熟萌发。

将荠菜胚培养在一种简单的渗透压未调整的无机盐培养基中，使用生长调节物质或提高蔗糖或主要盐类的浓度，能诱导更小的胚的生长，说明渗透压、生长调节物质之间的复杂作用。一种或几种生长调节物质的活性，依次被高浓度蔗糖或高浓度盐所控制，也可能是通过渗透过程阻止细胞伸长。因此，内外源激素间或与其他生长因子间保持某种平衡是确保激素促进幼胚发育的关键。如果激素浓度低，则不能促进幼胚生长；如果激素浓度过高，则会使幼胚发生脱分化而影响其正常发育。

4.其他成分

（1）氨基酸：谷氨酰胺、水解酪蛋白被广泛使用。

（2）维生素类：有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。维生素对发育初期的幼胚的培养是必需的。

（3）天然提取物：如椰乳、大麦胚乳、麦芽、马铃薯块、大豆等提取物，对胚生长有促进作用。

Van Overbeek等使用椰子汁培养曼陀罗的心形胚获得成功。

王伏雄（1963）发现蜂王浆对银杏幼胚正常分化有促进作用，可使胚的死亡率降低，抑制胚形成愈伤组织。

5.环境条件

（1）温度。对大多数植物胚的培养来说，温度保持在25℃～30℃较为合适。如在20℃下马铃薯胚培养较好。在25℃～30℃范围内柑橘、苹果、梨生长良好。32℃时棉花胚生长最好。桃则需要在变温条件下进行胚培养。

（2）光照。光对胚胎发育有抑制作用，一般黑暗或弱光下利于幼胚培养。

6.胚柄

研究表明，胚柄参与幼胚的发育过程。当胚发育到球形期时，胚柄也发育到最大。胚柄中的激素（GA）对幼胚发育有一定影响。

红花菜豆中，较老的胚，不管有无胚柄，均能在培养基中生长；但幼胚培养，不带胚柄会显著降低形成小植株的频率。