植物组织培养快繁技术：多次继代降低病毒浓度，实现柑橘脱毒

2023-11-20 理论教育版权反馈

【摘要】：多次继代的愈伤组织中病毒的浓度下降，甚至检测不到病毒。对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细胞共同存在于母体组织之中。因为珠心细胞与维管束系统无联系，由其产生的植株均为脱毒植株。这一技术可以脱去柑橘的主要病毒与类病毒，包括热处理不能去除的病毒。

（一）愈伤组织培养脱毒

通过植物的器官和组织培养诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，得到无病毒苗的方法，称为愈伤组织脱毒法。其理论依据是愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生出的植株也不带病毒。多次继代的愈伤组织中病毒的浓度下降，甚至检测不到病毒。例如，感染烟草花叶病毒的愈伤组织经机械分离后，仅有40%的细胞含有病毒，其原因可能是：病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度或有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。对病毒侵袭具有抗性的细胞可能与敏感的细胞共同存在于母体组织之中。受到花叶病毒侵染的烟草叶片中，暗绿色的组织或者不带病毒，或者病毒浓度很低。从这些组织中切取1 mm外植体进行培养，再生植株中有50%是脱毒苗。但是，愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株，所以生产上较少使用该方法生产脱毒苗。

（二）离体茎尖微体嫁接脱毒

茎尖微体嫁接技术指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖，以培养脱毒苗的技术。

木本植物茎尖培养难以生根的植株，先培育试管实生苗砧木，再切取0.1～1 mm、带3～4个叶原基的茎尖在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。这一技术在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功，有的已在生产上应用。

1.砧木培养

将新鲜种子去种皮后接种于含MS无机盐的无激素琼脂培养基上，在（25±2）℃下暗培养2周，再转光照培养。

2.茎尖培养

供体株多用热处理或在温室培养植株，对采集的嫩梢按茎尖培养脱毒的方法消毒和剥离茎尖。

3.嫁接

从试管中取出砧木，切去过长的根，保留4～6 cm长，切顶留1.5 cm左右茎。在砧木近顶处留一个U形切口，深达形成层，用刀尖挑去切口部皮层。将茎尖移植于砧木切口部，茎尖切面紧贴横切面。

4.嫁接苗培养

嫁接苗一般采用液体滤纸桥方式培养。事先在滤纸桥上开一小孔，将砧木的根通过小孔植入液体培养基，按常规光照培养管理。开始可用较低光照强度（800～1000 lx），长出新叶后可提高光照强度。(www.chuimin.cn)

5.移栽

嫁接苗培养3～6周，具有2～3片叶时按一般试管苗移植方式移入蛭石、河沙等基质中培养。

（三）化学疗法脱毒

1.病毒抗血清预处理

用齿舌兰环斑病毒（ORSV）的血清处理兰属离体分生组织，可提高再生植株中无ORSV的植株频率。

2.化学药品处理

许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等）对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗生素、放线菌素D、硫脲嘧啶、庆大霉素等。例如，将100 μg 2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY病毒（马铃薯Y病毒）。

（四）珠心胚培养脱毒

普通作物受精产生的种子绝大多数只形成一个合子胚，而柑橘类多胚品种中除一个合子胚外，还有多个由珠心细胞形成的无性胚（即珠心胚）。因为珠心细胞与维管束系统无联系，由其产生的植株均为脱毒植株。但珠心胚一般不能发育成熟，必须从胚珠中取出进行离体培养才能发育成正常的幼苗。这一技术可以脱去柑橘的主要病毒与类病毒，包括热处理不能去除的病毒。

（五）花药或花粉培养脱毒

花药和花粉培养的一般程序是脱分化诱导愈伤组织形成，分化出根、芽器官或胚状体，形成小植株。由于通过愈伤组织生长阶段，加之形成雄性配子体的小孢子母细胞在植物体内属于高度活跃、不断分化生长的细胞，因此，从理论上来讲花药含病毒质粒很少或几乎没有。

植物组织培养快繁技术：多次继代降低病毒浓度，实现柑橘脱毒

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