植物组织培养快繁步骤

植物组培快繁过程一般可分为四个阶段，即初代培养（无菌培养物的建立）、继代培养（茎芽增殖）、生根培养（根的诱导）和组培苗的驯化移栽。

（一）初代培养

1.外植体的选择

用于植物离体快速繁殖的外植体主要取决于植物种类和第二阶段茎芽增殖所采用的方式。一般木本植物、较大的草本植物以茎段比较适宜，因为茎段取材容易，可在一定的培养基上通过萌发出侧芽或产生不定芽成为进一步繁殖的材料。一些草本植物比较容易繁殖，或本身短小缺乏明显的茎，可采用叶片、叶柄、鳞片、花瓣等作为外植体，在一定条件下诱导使之产生不定芽。通常情况下，自然条件能产生不定芽的器官应首先被采用。

图5-2-6　月季组织培养流程图

2.外植体的接种

外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切割或分离出器官或组织，转接到无菌培养基上进行诱导培养的过程。

（1）培养基与培养条件。初代培养阶段最常用的培养基有MS培养基及其改良形式。加入一定量的细胞分裂素和少量生长素可促进生长。

图5-2-7　月季外植体培养

植物激素的使用因材料种类、增殖途径和培养阶段的不同有很大差异。1957年，Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的假说，认为植物离体培养过程中，器官的分化是由两类植物激素（即生长素和细胞分裂素）的相对浓度决定的。细胞分裂素比例高时，可促进芽的形成；生长素比例高时，有利于根的分化；当二者比例相当时，有利于形成愈伤组织。许多实验证明，这个假说对大多数植物是适用的。但由于植物不同组织中内源激素的水平不一样，因此，对于某一具体的形态发生过程来说，其所要求的外源激素水平是不同的，这就要求在对新的植物材料进行培养时，必须先通过一系列的试验来确定加入培养基中的细胞分裂素和生长素的种类、浓度及比例，以取得最佳的增殖效果。

（2）外植体的修剪、整理、清洗。

（3）外植体的接种、培养（外植体的清洗、接种、培养方法见学习任务4）。

（4）污染及其防治。接种后培养基上如出现微生物污染会导致培养失败。初代培养过程中污染率较高。造成污染的原因是多方面的，工作中必须有针对性地采取预防措施，将接种后的污染率降到最低。

①培养基。制备培养基时操作不当会导致灭菌不彻底，如灭菌器内冷空气未排除干净；瓶口用封口物完全封严，使高压热蒸汽不能自由进入瓶内。这些只要在制备培养基时加以注意，认真按照要求规范化操作就完全可以避免。

图5-2-8　组培苗的污染现象

②植物材料。为了保持材料的生活力，灭菌时间不能过长，这样灭菌就不可能很彻底，接种后常有一定的污染率，大多数情况下为40%～80%。如果材料带菌很多，污染率就比较高，严重时可达100%，而干净的材料采取适当的灭菌措施后，污染率可能会很低，甚至无污染。通常多年生木本材料比一、二年生的草本材料带菌多，老的材料比幼嫩的材料带菌多，地下部分的材料比地上部分的材料带菌多，取材时应很好地加以选择，以减少污染的发生。如果室外生长的材料污染非常严重，可以将其枝条采回，在室内扦插后将新生的芽作为接种材料；也可就地在植物上套上塑料袋，待长出新的枝条后取作接种材料，或用抗生素和杀虫剂预先处理，从而得到较好的结果。

③人为污染。违反操作规程，操作人员或接种工具带菌等人为因素是造成污染的一个重要原因。接种前双手必须用肥皂洗净，并剪掉过长的指甲。工作中还要特别注意避免交叉污染，如器械被手污染后又污染接种材料，因此接种工具每用一次就要在酒精灯上灼烧灭菌，接种过程中经常用酒精擦拭手指。接种时严禁说话并要戴上口罩。

接种前，接种室应先喷雾灭菌，接种时要注意在酒精灯火焰附近操作，打开的瓶口在火焰的上方水平放置，以避免真菌的孢子落入瓶内。

（5）褐变及其防治。有些植物的外植体接种后发生褐变，甚至使培养基也变成棕褐色，严重影响材料的生长、分化。褐变可通过下列措施防治：

图5-2-9　河北杨叶片外植体的褐变

①在培养基中加入抗坏血酸（维生素C）、柠檬酸、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等抗氧化剂，或用抗氧化剂对材料进行预处理或预培养，或在抗氧化剂溶液中切割、剥离外植体，可预防醌类物质形成。

②连续转移。对于易褐变的材料，可将外植体不断转移到新鲜培养基上，从而减轻醌类物质的毒害作用。

③加入活性炭。在培养基中加入0.1%～0.5%的活性炭，可减轻褐变程度。

接种后的外植体送到培养室进行培养，外植体的前期培养，温度掌握在25℃～28℃之间，光照为8～10 h/d，经7～10 d观察，如果没有发现霉菌、细菌生长，则说明无菌培养物建立成功，可进行继代培养、扩大繁殖。

（二）继代培养

这一阶段是快繁技术最重要的环节，无菌培养物通过反复继代培养而不断增殖。

1.试管苗的增殖培养

初次培养所获得的芽、茎段、胚状体、原球茎能在短期内加倍增殖，这部分能增殖的培养材料被称为中间繁殖体，这一增殖过程被称为继代培养。增殖培养基对于一种植物来说，每次几乎相同。这一阶段，培养基中细胞分裂素与生长素含量的比值增大，有利于茎芽的产生。组培苗有适宜的培养条件，在营养供应和激素调控下，排除其他生物的竞争，能够按照几何倍数增殖。一般情况下，在4～6周内增殖3～4倍是很容易做到的。如果在继代转接的过程中能有效地防止菌类污染，又能及时转接继代，一年内就能获得几十万株甚至几百万株小苗。这个阶段就是快速繁殖的阶段。

图5-2-10　蝴蝶兰试管苗继代增殖

继代培养中扩繁的方法包括切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。

（1）切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS基本培养基。

（2）分离芽丛适用于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小，可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待稍大时，再分离开继续培养。

（3）分离原球茎。将原球茎切割成小块，或给予针刺等损伤，或在液体培养基中振荡培养，加快其增殖进程。

（4）分离胚状体。将由外植体或愈伤组织产生的胚状体进一步切割，转接于增殖培养基中，扩大胚状体数量，常用液体振荡培养方式。

2.继代培养的影响因素

（1）植物材料。不同种类的植物，同种植物的不同品种，同一植物的不同器官和不同部位，继代培养能力各不相同。一般是草本植物＞木本植物；被子植物＞裸子植物；年幼材料＞老年材料；刚分离组织＞已继代的组织；胚＞营养组织；芽＞胚状体＞愈伤组织。以腋芽或不定芽增殖继代的植物，在培养许多代之后仍然保持着旺盛的增殖能力，一般较少出现再生能力丧失的情况。

（2）培养基。在规模化生产中，培养的植物品种一般比较多，而且来源也比较复杂，品种间的差异表现得非常明显。培养基的配制和使用一定要多样化，否则会造成一些品种因为生长调节剂过高或过低而严重影响繁殖和生长。另外，对于同一品种，适当调整培养基中生长调节剂的浓度也是非常重要的，其目的主要是保证种苗的质量，同时维持一定的繁殖基数。

一些植物在开始继代培养时需要加入生长调节剂，经过几次继代培养后，加入少量或不加生长调节剂也可以生长。如胡萝卜薄壁组织在初代培养时加入6～10 mol/L IAA才能达到最大生长量，但继代培养10代以后，在不加IAA的培养基上也可达到同样的生长量。兰科植物原球茎的继代培养也有类似情况。

（3）培养温度。培养温度应大致与该植物原产地生长所需的最适温度相似。喜欢冷凉的植物，以20℃左右较好，热带作物需在30℃左右的条件下才能获得较好的生长。如香石竹在18℃～25℃随温度降低生长速度减慢，但苗的质量显著提高，玻璃化现象减少，高于25℃时，苗徒长细弱，玻璃化或半玻璃化苗明显增加。在桉树继代培养中发现，如果总在23℃～25℃条件下培养，芽会逐渐死亡，但如果每次继代培养时，先在15℃下培养3 d，再转至25℃下培养，生长良好。

（4）继代周期。一些生长速度快或者繁殖系数高的种类如满天星、非洲紫罗兰等，继代时间比较短，一般不超过15 d。生长速度比较慢的种类如非洲菊、红掌等，继代时间就要长一些，30～40 d继代1次。继代时间也不是一成不变的，要根据培养目的、环境条件及所使用的培养基配方确定。在前期扩繁阶段，为了加快繁殖速度，苗刚分化时就可切割继代，而无须待苗长到很大时才进行继代。后期在保持一定繁殖基数的前提下进行定量生产时，为了有更多的大苗用来生根，可以间隔较长的时间继代，达到既可以维持一定的继代增殖量，又可以提早生产出组培苗成品的目的。

（5）继代次数。继代次数对增殖率的影响因培养材料而异。有些植物如葡萄、黑穗醋栗、月季和倒挂金钟等，长期继代可保持原来的再生能力和增殖率。有些植物则随继代次数增多而增加变异频率，如继代5次的香蕉不定芽变异频率为2.14%，继代10次后为4.2%，因此香蕉组培苗继代培养不能超过1年。还有一些植物长期继代培养会逐渐衰退，丧失形态发生能力，具体表现为生长不良、再生能力和增殖率下降等。

在快速繁殖中初代培养是一个必经的过程，继代培养则是经常性不停的增殖过程。但在达到相当数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。

3.试管苗的增殖量

由于试管苗在接近理想的条件下生长分化，不受季节的限制，并且有人为提供的外源激素的促进，增殖速度很快。试管苗的增殖量通常按接种的繁殖体块数或培养瓶数计算，看能得到多少个（瓶）中间繁殖体，这两种方法都比较准确。每一周期（从接种当天到再次可供接种的当天）需要多少天、每一周期每一瓶能接种扩繁多少瓶（每周期都能稳定地达到）、每瓶有多少苗，掌握这几个基本数字即可计算。

（三）生根培养

任何植物继代的次数都是有限的，继代次数过多易发生变异，而且继代繁殖一定数量后，培养室的容量就会饱和，必须分流进入壮苗、生根培养阶段。因此，在生产中，继代的次数与繁殖的数量要计划准确，即繁殖一定的数量且不超过继代限度，达到工厂化育苗规范标准的最佳效益。

图5-2-11　河北杨试管苗生根培养

在有细胞分裂素存在的情况下，由腋芽和不定芽长成的枝条一般都没有根。为了得到完整的植株，必须把无根枝条转移到生根培养基中诱导其生根。培养基内无机盐浓度高时有利于产生茎、叶，较低时有利于生根，所以生根培养基一般大量元素减半或用1/4量，不含或仅含有浓度很低的细胞分裂素，并加入适量生长素，使用最多的是NAA，其次是IBA和IAA。由于嫩枝本身能合成丰富的生长素，所以有些植物可在无激素的培养基上生根。为了增强植株的自养能力，生根阶段培养基中蔗糖浓度一般降至1.0%～1.5%，并相应提高培养室的光照强度（3000～10000 lx）。在生根培养基上，无根苗一般1～4周即可生根。生根的过程中苗长高了，植株健壮了，有利于驯化炼苗。一些容易生根的植物在增殖培养基上延长培养时间便可生根，无须更换培养基，即可直接获得完整的试管苗。

有些植物由于增殖阶段细胞分裂素用量过大，在生根培养基上可能仍不停止增殖，导致其生根困难，此时可延长生根培养阶段，将材料在生根培养基上再转接一次，使残留的细胞分裂素浓度逐渐降低，促使其生根。

胚状体发育成的小苗常常带有已分化的根，可以不经诱导生根的阶段。但经过胚状体途径发育的苗数量特别多，且个体较小，需要在低浓度植物激素的培养基上培养，以便壮苗。

除了在生根培养基上进行生根培养外，有些植物可以采用试管外生根的方法，即把在离体条件下形成的枝条当作微插条处理，使它们在一定的基质中生根。采用这种方法时，枝条基部切口要先经过生长素或生根粉处理（浸泡或浸蘸），然后把它们种在基质中，由于减少了一次无菌操作步骤，因而可降低生产成本。

（四）组培苗的驯化（炼苗）

植物组织培养过程中培育出来的苗通常称为试管苗或组培苗。组培苗是在无菌、有营养供给以及弱光、高温且100%的相对恒湿条件下生长的，因此在生理、形态等方面都与自然条件下生长的正常小苗有很大差异。所以组培苗要通过驯化锻炼即炼苗过程，使它们逐渐适应外界环境，这样才能保证组培苗顺利生长，应用于生产。

（1）组培苗生长的环境特点：高温且恒温、高湿、无菌、弱光。

（2）组培苗的特点。(www.chuimin.cn)

①植株细弱，茎、叶表面角质层不发达，气孔数目少，调节能力差。

②茎、叶虽是绿色，但叶绿体的光合作用较差。

③根的吸收能力较低，出瓶后根系吸收的水分难以满足小苗蒸腾的消耗，小苗易失水萎蔫。

④组织幼嫩，机械组织不发达，容易发生机械损伤，对逆境的适应和抵抗能力差。

（3）炼苗：也称“瓶炼”，目的在于提高试管苗对外界环境的适应性，提高光合能力，促使试管苗健壮，从而提高试管苗的移栽成活率。

炼苗的时间、时机和方式随植物种类而定。一般做法是将已生根的试管苗连同容器由培养室转移到温室，在半遮阳的自然光下进行锻炼。逐渐打开容器盖进行适应性锻炼，并注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度，转向有菌环境。这样幼苗周围的环境就会逐渐与自然环境相似。

炼苗时间一般1～2周。

图5-2-12　蝴蝶兰组培苗炼苗

（五）组培苗的移栽

为了做好试管苗的移栽工作，应该选择合适的基质，并配合相应的管理措施，移栽空间应先保湿，以后逐渐敞开，从而确保整个组织培养工作顺利完成。

1.移栽基质

选择移栽基质的原则：具备透气性、保湿性和一定的肥力；容易灭菌处理；不利于杂菌滋生。

一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加黏着力和肥力，可按一定比例搭配草炭土或腐殖土。

图5-2-13　蝴蝶兰组培苗出瓶移栽

（1）常用的配方：

①一般用珍珠岩、蛭石、草炭土或腐殖土，比例为1：1：0.5。

②用砂子、草炭土或腐殖土，比例为1：1。

基质不能太干燥，以手捏成团、松开不散的潮湿状态为宜。

（2）常用的灭菌方法：

①在培养基质中掺入75%百菌清可湿性粉剂200～500倍液，以进行灭菌处理。

②使用前应高压灭菌。

③烘烤以消灭其中的微生物。

④用0.3%～0.5%高锰酸钾喷洒基质灭菌。

2.移栽容器的选择

常用的移栽容器有育苗盘、黑色塑料育苗钵。通常选择塑料育苗钵，其具有成本低、可以反复使用、占地面积小、营养空间大、可以有效吸收营养等优点，非常适合大面积生产。

3.移栽方法

（1）组培苗的出瓶移栽：出瓶移栽也叫“盘炼”。

①移栽技术：对于大多数木本植物和部分草本植物，适合的移栽时间是根原基突起或形成2～3 mm长的短根时，此时取苗不伤根，带培养基少，移栽后根迅速固着于基质并吸收营养，成活率高。

图5-2-14　北海道黄杨组培苗的生根移栽

图5-2-15　蝴蝶兰组培苗的容器移栽

a.从试管中取出已生根的小苗，用0.1%多菌灵溶液轻轻洗掉根部粘着的培养基，避免伤根。清洗一定要干净，以防残留培养基滋生杂菌。

b.如果根过长，可用锋利的剪刀剪掉一部分，再蘸生长素（50 mg/L IBA或NAA）后移栽。

c.移植时用镊子或筷子粗的小棍在基质中插一小孔，然后将小苗插入。注意幼苗较嫩，应防止弄伤，移栽后把苗周围基质压实，浇透水。

d.将苗移入高湿度的环境中，一般是在大棚内搭设小拱棚。

②移栽管理。

a.移栽后的最初几天要求空气湿度保持90%以上，每天喷雾2～3次，使叶面的蒸腾减少。因为在培养瓶内湿度接近饱和，在这样的条件下生长的试管苗茎、叶表面防止水分散失的角质层几乎没有，根系也不发达，移入基质后难以保持水分平衡，即使基质中有足够的水分也不行，必须要求高湿的空气，使叶面的蒸腾减少。当试管苗适应了新的环境后，逐渐降低湿度，最终过渡到在温室或自然条件下生长。

b.温度变化不宜过大。一般喜温植物控制在25℃左右，喜凉植物以18℃～20℃为宜。温度过高会使蒸腾加强，杂菌滋生；温度过低，移栽苗生长缓慢，或不易成活。如果能利用一些设备（埋设地热线、温室地槽等）使基质温度高于气温2℃～3℃，会有利于生根并促进根系生长。

c.试管苗移栽后喷施一定浓度的杀菌剂，可有效保护幼苗，以利于成活。

d.移栽后的试管苗由异养生长转变为自养生长，进行光合作用，因此需要一定强度的光照。但过强的光照会破坏叶绿素，使叶片失绿，移栽苗成活延缓，还会加强蒸腾作用，加速水分的散失。因此，移栽过程中应避免强烈的直射光，以较高强度的散射光为好，经过一段时间的生长后，再逐步加强光照，使苗慢慢适应自然环境条件。

e.移栽一周后，可进行叶面施肥。

经过“盘炼”后，组培苗侧根上逐渐产生众多根毛，当观察到茎段开始高生长时就标志着“盘炼”圆满完成，组培苗可以上盆或进行大田移栽了。

（2）组培苗的容器移栽：通常选择8 cm×8 cm或10 cm×10 cm的黑色软塑料育苗钵。黑色软塑料育苗钵可以吸收光能，提高基质的温度，特别适合早春容器移栽育苗。

移栽技术：

①配制移栽基质。（方法同出瓶移栽）

②清洗试管苗根部的培养基。（方法同出瓶移栽）

③在育苗钵中装入基质至1/4。

④左手轻拿试管苗，右手将苗根均匀地分布于育苗钵中，然后填入基质，距育苗钵上沿1 cm即可。

⑤用双手捏住钵沿两边轻轻地在地上蹾几下育苗钵，使苗根与基质贴紧。

⑥浇透水。

⑦将移栽入钵的小苗放在高湿环境中，保持空气湿度达90%以上（大棚内搭设小拱棚）。逐渐降低空气湿度，过渡到自然环境。

移栽期间的管理同出瓶移栽。

出瓶移栽和容器移栽的组培苗经过一段时间后就可上盆或进行大田移栽了。

问题2

植物组培快繁有很多优点，那么是否每种植物都可采用组培快繁技术呢？

基本知识