植物组织培养的材料几乎包括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。北海道黄杨选用带有饱满而未萌发侧芽的当年生嫩茎做外植体，取得了良好效果。选取材料时要对所培养植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选出合适的、最易表达全能性的部位作为外植体。......
2023-11-20
植物组织培养技术中的外植体消毒方法
【摘要】：因为植物组织培养是在无菌条件下进行的，所以无菌的外植体是取得组织培养成功的基本保证。因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要环节。
植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。因为植物组织培养是在无菌条件下进行的，所以无菌的外植体是取得组织培养成功的基本保证。接种培养前必须对材料进行消毒处理，消毒要求既把材料表面的各种微生物杀灭，又不能损伤或只轻微损伤材料而不影响其生长。因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要环节。
1.外植体的冲洗、刷洗
植株在生长过程中会受到土壤、肥料中杂菌的污染，所以采回并修剪好的外植体应首先用自来水冲洗，然后用浓洗衣粉水浸泡，用软毛刷轻轻刷洗后，再用清水冲洗干净。
2.常用的消毒剂及其效果比较
不同的外植体，不同年龄以及不同季节选取的外植体，消毒方法也不相同。首先是消毒剂的种类、浓度不同，其次是消毒的时间不同，最终是消毒效果也不同。
常用的消毒剂如表4-1-5所示。理想的消毒剂应消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。
表4-1-5 常用消毒剂的使用方法及效果
（1）酒精：酒精是最常用的表面消毒剂，以70%～75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。
酒精具有较强的穿透力，可使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，有利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。
（2）升汞：又称氯化汞，Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。
（3）次氯酸钠：次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。
（4）漂白粉：漂白粉的有效成分是次氯酸钙［Ca（ClO）2］，消毒效果很好，对环境无害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。(www.chuimin.cn)
（5）过氧化氢：也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。
（6）新洁尔灭：这是一种广谱表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。
3.外植体的消毒方法
（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒：消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。
消毒工作在超净工作台上进行，先用70%酒精浸泡10～30 s，以无菌水冲洗2～3次，然后按材料的老嫩和枝条的坚实程度，分别用2%次氯酸钠浸泡10～15 min或用0.1%升汞浸泡5～10 min。消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分接触。若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴Tween-20，最后用无菌水冲洗3～5次。
（2）果实及种子的消毒：先用自来水冲洗10～20 min，再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸泡10 min，后用无菌水冲洗2～3次。种子则先用10%次氯酸钠浸泡20～30 min，难以消毒的可用0.1%升汞消毒5～10 min。对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡8～10 min。
（3）花药的消毒：用于组织培养的花药多未成熟，其外面有花萼、花瓣或颖片保护，处于无菌状态。消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2～3次，再在漂白粉中浸泡10 min，最后用无菌水冲洗2～3次。
（4）根及地下部器官的消毒：由于这类材料生长于土壤中，表面带菌量大，消毒较为困难。可先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸泡5～10 min或2%次氯酸钠中浸泡10～15 min，最后用无菌水冲洗3次。
在操作时要根据材料的大小、老嫩、质地等差异作出判断后，再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间，切不可生搬硬套。消毒的最佳效果应是最大限度杀死材料上的微生物而又对材料的损伤最小。
问题2
外植体消毒灭菌是外植体培养成功与否的关键，那么外植体消毒灭菌工作应遵循怎样的操作流程呢？
基本操作
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