食品生物技术中的免疫学检测技术简介

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：（二）免疫学检测技术的原理免疫学检测技术的原理是借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。ELISA是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。

（一）基本概念

1.抗原（antigen）

凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性称为免疫原性（immunogenicity）；与相应抗体结合发生反应的特性称为反应原性（reactionogenicity）或免疫反应性（immunoreactivity），二者统称为抗原性（antigenicity）。既具有免疫原性又具有反应原性者称为完全抗原（complete antigen）。只有反应原性而没有免疫原性者称为不完全抗原（incomplete antigen），亦称半抗原（hapten）。半抗原又有简单半抗原（simplehapten）和复合半抗原（complexhapten）之分。

2.抗体（antibody）

是在抗原刺激下产生的，并能与之特异性结合的免疫球蛋白。抗体在体内存在的形式有许多种。抗体是由B细胞分化的浆细胞产生的，存在于组织液、淋巴液、血液和脑脊髓液等体液中，抗体的化学本质是免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。

3.血清学试验

抗原抗体在体外发生的特异性结合反应、抗原抗体的反应一般都要用血清，故称为血清学试验或血清学反应。通过血清学试验，可用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体检测未知的抗原。血清学检测方法包括经典的凝集反应、沉淀反应和补体结合反应，以及现代免疫学新方法如酶联免疫分析技术、放射免疫分析技术等。

（二）免疫学检测技术的原理

免疫学检测技术的原理是借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。定性检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在；同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。对抗原或抗体进行定量检测时，反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复合物的浓度成函数关系。根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体（或抗原）的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原（或抗体）量成正比。也就是抗体（或抗原）浓度一定时，免疫复合物越多，则样品中的抗原（或抗体）量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。可作为抗原进行检测的物质分为以下4类：

①各种微生物及其大分子产物：细菌、病毒、真菌、各种毒素等。

②生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白（如各类免疫球蛋白、补体的各种成分）可溶性血型物质、激素、细胞因子及癌胚抗原等均可作为抗原进行检测。

③人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原（如CD抗原）、同种异型抗原（ABP和Rh血型抗原）、肿瘤相关性抗原等。

④各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测。例如对某些病人在服用药物后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。在食品检验中可用于药物残留和激素的检测。

（三）免疫学检测技术

免疫学检测技术是以抗原抗体的特异性反应为基础建立的，由此衍生出的检测方法种类繁多，几乎所有的免疫学方法都可以用于食品安全检测，而在食品安全检测应用中有普及潜力的主要有以下几种。

1.酶联免疫吸附测定（ELISA）

酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是继放射免疫测定技术之后发展起来的一项新的免疫学技术。自20世纪70年代出现开始，ELISA就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点。在临床和生物疾病诊断与控制、食品检验检疫等领域中倍受重视，成为检验中最为广泛应用的方法之一。

ELISA是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。其基本原理是抗体（抗原）与酶结合后，仍然能和相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，将待检样品事先吸附在同相载体表面称为包被；加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原）与吸附在固相载体上的相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液洗掉；当加入酶的底物时，底物发生化学反应，呈现颜色变化，颜色的深浅与待测抗原或抗体的量相关，借助分光光度计的吸光度计算抗原（抗体）的量，也可用肉眼定性观察。因此，它可定量或定性地测定抗原或抗体。

随着ELISA在生物检测分析领域的广泛使用，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，逐渐演变出了几种不同类型的检测方法：夹心法、间接法、竞争法、双位点一步法、PCR-酶联免疫测定法和斑点免疫酶结合试验等。(www.chuimin.cn)

自建立ELISA方法以来，其在食品安全中的应用就得到了充分的体现。1977年，LaWell首先采用了ELISA法来检测了黄曲霉毒素，目前食品中许多致病菌如沙门氏菌、大肠杆菌O157等微生物都可以用此方法来进行检测。另外主要的药物残留如抗生素类、磺胺药类、呋喃药类、激素药类和驱虫药类等的ELISA检测方法都已经建立，其中T-2毒素、黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等的ELISA检测方法已列入我国标准方法。但ELISA对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。虽然如此，人们对该方法的热情依然不减，而基于ELISA方法的检测抗生素、农药、食品添加剂等的残留检测试剂盒已经实现了产业化，它正以其方便、廉价的优越性成为人们钟爱的首选方法。

2.免疫胶体金技术

Faulk于1971年把胶体金引入免疫化学，被公认为免疫胶体金技术的诞生。近年来，研究人员根据胶体金的物理及化学性能，设计的各种检测方法能在几十分钟甚至几分钟内就获得检测结果，从而判断样品中是否含有待检测的物质，并初步判定是否超标，但是该方法不能进行准确的定量。我国赖卫华等应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A，发现赭曲霉毒素A快速检测试纸条的检测限为10ng/mL，检测时间为10min，使用方便，经济适用。而谌志强等用胶体金免疫渗滤法检测大肠杆菌O157：H7后认为此方法在基层进行细菌检测中具有良好的推动作用。许春光等在用胶体金同ELISA结合检测盐酸克伦特罗后发现该方法的敏感性和特异性均可达到ELISA的水平。所以，可以认为该方法具有良好的普及潜力。目前由此已经衍生出许多与之相结合的检测方法，如链霉亲和素-胶体金探针（SAG），胶体金免疫层析技术等。总之，它正以其优越的可操作性在食品安全检测中发挥出了越来越重要的作用。

3.免疫磁珠法

免疫磁珠法是非常有效的从食品成分中分离靶细菌的方法。它应用抗体包被的免疫磁珠，同食品样品的提取液混合，样品中病原菌特异性地与抗体结合到固定的颗粒上，分离磁珠即可分离出病原菌，不仅缩短分析时间，而且克服了选择性培养基的抑制作用问题。2001年世界标准化组织（ISO）发布的《食品和动物饲料微生物学-大肠杆菌O157检测方法》（ISO16654）就采用了免疫磁珠分离技术。TanW认为应用该方法不仅能够节约时间，而且灵敏度也有很大的提高。寇运同等用免疫磁珠捕集法快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌检测低限均达到甚至超过了传统方法，检测结果基本不受干扰菌影响，简便快速、便于灵活掌握。目前认为食品卫生检验中的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌等方法已经成熟，并且被越来越多的应用。

4.免疫捕获PCR法

根据特异性抗体与病原菌菌体抗原特异性结合的免疫学原理，将特异性抗体包被于磁珠或PCR管壁上，富集或捕获菌悬液和标本中的病原菌，再进行PCR反应，即可检测目标病原菌。牛建军等对大肠杆菌O157：H7检测认为基于生化特性的传统培养法约需72h，而本方法只需4～5h，样品中大肠杆菌O157：H7的含量只要不少于10cfu/mL，经过6h增菌均能检测出来。Waller等用该方法对食品中空肠弯曲菌进行分离定量分析，认为效果非常明显。而李晓虹等用免疫磁珠和复合PCR联用，从样品中直接浓缩获取单增李斯特菌，用IMS/PCR方法和SN方法同时检测了样品162份，结果通过API方法确证，符合率达到100%。建立的IMS/PCR方法较常规方法简便、快速、灵敏度高，可达1.5cfu/mL，在24h可快速检出单核细胞增生李斯特菌，有很好的应用前景和研究价值。

5.免疫传感器技术

免疫传感器技术是将免疫测定技术与传感技术相结合的一类新型技术，具有精确度、灵敏度高、特异性强、样品前处理简单的特点。对于有的样品甚至不需要前处理过程，响应和检测迅速，每个样品只需几十秒至几分钟。选择性好、操作简单、携带方便、能重复利用，并能实现现场检测和在线检测等优点，有望发展成为食品安全检测中最有效的新技术。

运用该方法可以按照不同的使用方法分为多种，目前已经可以用于大肠杆菌O157：H7等多种细菌，而用电化学免疫传感器检测黄曲霉毒素M1，用光纤免疫传感器技术检测低水平的单核细胞增生李斯特菌，用压电晶体免疫传感器检测葡萄球菌肠毒素B都有明显效果。

6.免疫荧光技术

免疫荧光技术是用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标记技术，又称荧光抗体技术。它是标记免疫技术中发展最早的一种，由Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。其原理是将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位，主要有直接法和间接法。目前对于痢疾志贺氏菌、霍乱弧菌、布氏杆菌和炭疽杆菌等的实验诊断有较好效果。荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析，既可用于检测受染细胞内的病毒抗原，也可检测受染细胞表面的病毒抗原，另外，该技术在检测抗生素残留方面也有一定的应用。总之，由免疫荧光技术衍生出的许多方法都可以发挥到食品安全检测的各个领域，为更加精确的检测提供方便快捷的方法。

7.免疫芯片

免疫芯片指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵，是继基因芯片之后提出的一种新型的生物芯片技术。它将几个、几十个，甚至几万个或更高数量的抗原（或抗体）高密度排列在一起制成，目前可以分为间接法免疫芯片、双抗体夹心法免疫芯片、竞争法免疫芯片、免疫-PCR芯片、酶标法免疫芯片、放射性同位素法免疫芯片、荧光法免疫芯片、金标法免疫芯片以及生物素-抗生物素蛋白法免疫芯片等。据不完全统计，已有4家美国公司基于液态芯片技术平台产品获得FDA的批准用于临床诊断。用该方法进行污染物的检测具有灵敏度高、特异性强、短时间内可以检测多种待测物的优点，但是在检测前需要对样品进行提取、纯化等预处理。当前制约免疫芯片广泛应用的根本原因在于如何获得更多的针对各种污染物的高效价单克隆抗体。采用多克隆抗体检测时，标记的抗体可能会与封闭液中的蛋白质发生非特异性结合，导致荧光背景的升高。我国已经能生产用于商品化的检测克伦特罗、磺胺二甲嘧啶、链霉素、恩诺沙星等多种兽药的残留情况的免疫芯片。

8.化学发光免疫技术

化学发光免疫技术是基于放射免疫分析的基本原理，将化学发光与免疫测定结合起来的一种高效检测手段。这种方法由Halman于1977年建立，其特点是以化学发光物质为示踪物，是一种简便、快速、灵敏度高的测定方法，且重复性好，无放射性污染。可以将其分为化学发光酶免疫分析、微粒体发光免疫分析、电化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、激光免疫分析等。由于这些方法在测试中不使用有害的试剂，所以具有一定的推广前途，用此方法可以进行细菌、病毒、毒素等物质的检测。

总之，随着人们生活水平的提高以及科技的发展，对食品安全的要求也越来越高，国内外已经有很多公司生产了基于免疫学的食品安全检测仪器，并且由于其快速、廉价、方便的特点被人们广泛接受，相信不远的将来，会有更好的免疫学方法应用到食品安全的检测中。

食品生物技术中的免疫学检测技术简介

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