不同类型的核酸探针及其应用

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：核酸探针技术，是20世纪晚期在生物学领域中发展起来的一项新技术。（二）核酸探针的种类根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡糖核苷酸探针等。现已获得的DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。根据标记物核酸探针可分为有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。

核酸探针技术，是20世纪晚期在生物学领域中发展起来的一项新技术。核酸探针又称基因探针（gene-probe），是指一段用放射性同位素或其他标记物（如酶与荧光素等）标记的已知序列的核酸片段。

（一）核酸探针检测的原理

核酸探针检测所依据的是核酸分子杂交，其工作原理是碱基配对，即两条碱基互补的DNA链（或两条碱基互补的DNA链和RNA链）在适当条件下可以按碱基配对原则，形成杂交DNA分子，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。

每个生物体的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定的，例如一种微生物的病原性就是由于这种微生物含有并表达了某个或某些有害的基因而产生的。从理论上讲，任何一个决定生物体特定生物学特性的DNA序列都应该是独特的。如果将某一种微生物的特征基因DNA双链中的一条进行标记，例如用32P同位素标记，即可制成DNA探针。由于DNA分子杂交时严格遵守碱基互补配对的原则，通过考查待测样品与标记性DNA探针能否形成杂交分子，即可判断样品中是否含有此种微生物，并且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。

（二）核酸探针的种类

根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡糖核苷酸探针等。

基因组DNA探针（genomic probe）是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得的DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

cDNA（complementary DNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由反转录酶催化而产生的，该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。

RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。

人工合成的寡聚核苷酸探针是指根据已知的核酸序列或根据蛋白质的氨基酸顺序推导出核酸顺序（需考虑密码子的兼并性），采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，多用于克隆筛选和点突变分析。

根据标记物核酸探针可分为有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。

放射性标记探针用放射性同位素作为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的放射性同位素有32P、3H、35S，以32P应用最普遍。放射性同位素标记的探针灵敏度较高，可以检测到pg级，但由于半衰期限制，标记后存放的时间有限，且对操作者和环境有放射性危害，因而近年来越来越多地被非放射性标记物所取代。

目前比较常见的非放射性DNA探针检测系统是通过酶促反应将特定的底物转变为生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的。常用的标记物包括金属、荧光染料、地高辛、生物素和酶等，可通过酶促反应、光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。

（三）核酸探针的标记方法

1.缺口平移法

用适当浓度的DNA酶I在探针DNA双链上制造一些缺口，然后在DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性和5'→3'聚合酶活性作用下，先切去带有5'磷酸的核苷酸，同时将标记的互补核苷酸（如γ32ATP）等补入缺口，两种活性的交替作用使缺口不断向3'的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断被标记的核苷酸所取代。

2.随机引物法(www.chuimin.cn)

将DNA水解、分离得到的六脱氧核苷酸作为随机引物加到待标记DNA探针溶液中，经变性退火后，引物与单链DNA在多处互补结合，同时在引物的3'-OH端发生延伸反应，标记的单核苷酸便掺入到新合成的DNA链中。

3.末端标记法

适合标记合成的寡核苷酸探针，它是在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将标记ATP的磷酸连接到带羟基的待标记寡核苷酸5'末端上。

4.PCR标记法

将标记的dNTP加到待扩增DNA溶液中，在DNA聚合酶的作用下，经过多次变性、退火和延伸过程的重复性循环，使合成的DNA片段中掺入标记物。这种标记法简便、快速、重复性好，对模板DNA纯度的要求低，适合大量制备。

（四）核酸探针杂交技术

目前使用的DNA探针杂交方法总体上可以分为两类：一类是异相杂交（即固相杂交技术），另一类是同相杂交（即液相杂交技术）。近年来DNA探计杂交技术在食品安全检测中的应用研究十分活跃，目前已可以用DNA探针检测食品中的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌等。该法特异性强、灵敏度高，不需要进行复杂的细菌扩增和获得纯培养而节省了时间，而且提高了检测的准确性。

1.异相杂交

Southern印迹法是最早的DNA探针杂交技术，由英国分子生物学家Southern所发明。其操作步骤：首先将从待检测样品中提取的DNA经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将带有DNA片段的琼脂糖凝胶浸泡在碱中使DNA变性，然后将变性的DNA转移到硝酸纤维素膜上，在80℃下烘烤4～6h，使DNA牢固地吸附在膜上。与放射性标记的DNA探针进行杂交数小时后，通过洗涤除去未杂交的DNA探针。将硝酸纤维素膜烘干后进行放射自显影。杂交结果即可在X光片上显示出来。

目前大多是先制成标记的脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dGTP和dTTP），然后来用缺口平移法、末端标记法、随机引物法或聚合酶链反应法（PCR）等技术标记到核酸分子上。

2.同相杂交

（1）双探针常规技术　同相杂交技术最早由Heller和Mirrison提出，该项技术的特点是不需要支持物，减少了固定DNA以及去除未杂交DNA等操作。常规的同相杂交技术中使用了2个探针，这2个探针分别与目标DNA的2个相邻区域互补。第1个探针在3'末端标记，第2个探针在5'末端标记，利用标记物的光谱特性，使第一标记物为第二标记物提供能量。当探针与目标DNA杂交时，2个探针彼此靠近，通过光吸收或化学反应激发供体标记物，并通过能量转移引起受体标记物的激发。因此，通过测定第一标记物发射光的减少或第二标记物发射光的增加，即时定量考查DNA探针的杂交情况。

（2）分子信标　分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。在长度为15～30mer（调制误差比）寡核苷酸探针的两端分别加上5～8mer序列互补的茎区。在自由状态时，由于茎区互补序列的结合使探针分子形成发夹结构，所以又被称为发夹探针。探针的5'端及3'端分别连接荧光索分子及淬灭剂分子。

自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与淬灭分子靠近（为7～10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎互补区被拉开，荧光分子和淬火分子距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。

由于食品中污染的致病菌的数量很小，所以通过PCR技术可以特异性扩增出致病菌的某一特定的DNA序列。因此，PCR技术常与DNA探针技术联合使用，用于检测样品中微量的病原微生物，大大提高了DNA探针检测技术的灵敏度。

不同类型的核酸探针及其应用

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