PCR检测技术在食品生物技术中的应用及优势

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：30～40个循环后，对PCR产物进行电泳检测。多重PCR特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交同样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失。应用多重PCR可同时检测多个目的基因的特点，在食品微生物检验、转基因植物的检测中显示了诱人前景。将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而出现了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。通常realtime PCR的实时检测是使用荧光物质来进行的。

PCR是在体外模拟DNA复制的过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶沿5'→3'方向掺入单核苷酸来特异性地扩增DNA片段的技术。整个反应过程通常由20～40个PCR循环组成，每个循环由变性—退火（复性）—延伸3个步骤组成：第一步升高温度（94～96℃，1至数分钟）使DNA变性，氢键打开，双链变成单链，作为DNA扩增的模板；第二步降温（50～65℃，1至数分钟）退火，寡核苷酸引物与单链DNA模板进行特异性的互补结合，即复性；第三步温度再上升到适宜的温度（72℃，1至数分钟），DNA聚合酶以单链DNA为模板沿5'→3'方向掺入单核苷酸，使引物延伸合成模板的互补链。经过变性—退火—延伸这样一个PCR循环，1条双链就变成了2条；再来1个循环，就变成了4条。如此循环往复，就使得DNA片段得到有效的扩增。只需要两三个小时就可完成25～30个循环，可将单一拷贝的基因扩增100万～200万个拷贝。

（一）PCR种类及原理

Mullis等在建立PCR方法的初期，是用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段催化引物的延伸反应。由于此酶在变性温度下会失活，所以每一轮反应都需重新加一次酶，这样反应只能扩增短片段，产量不高，操作烦琐。常规应用受到限制。其后人们采用从嗜热细菌分离的耐热TaqDNA聚合酶解决了这一问题，现在天然的TaqDNA聚合酶或经基因工程重组生产的TaqDNA聚合酶在高温下都很稳定，故在整个过程中不需要添加新的TaqDNA聚合酶，从而使PCR技术迅速发展起来。结合其他技术衍生出了许多优良技术，如反转录PCR、多重PCR、不对称PCR、错配PCR、原位PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-ASO、RAPD-PCR、DDRT-PCR、免疫PCR、实时PCR等。

1.多重PCR

常规PCR内一对引物扩增，只产生一个特异的DNA片段。许多情况下，欲检测的基因十分庞大，可达上千个千碱基对（kbp），这些基因常常多处发生突变或缺失，而且这些改变相距数十至数百个千碱基对，超过PCR扩增DNA片段的长度，欲检测整个基因的异常改变，采用常规PCR需分段进行多次扩增，费时费力，采用多重PCR（multiplex PCR）则可克服上述问题。多重PCR就是首先设计合成位于多个缺失区域两侧的引物，每对引物之间核苷酸长度尽量不同，以使扩增后电泳分析时有各自的条带位置，然后将多对引物加入反应体系，进行常规PCR扩增。30～40个循环后，对PCR产物进行电泳检测。如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度变短或片段消失，从而发现基因异常。多重PCR特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交同样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失。应用多重PCR可同时检测多个目的基因的特点，在食品微生物检验、转基因植物的检测中显示了诱人前景。

2.免疫PCR

免疫PCR（immune PCR）就是利用抗体与DNA特异结合来检测抗原，把抗原抗体反应与PCR联合应用而建立的一种抗原检测系统。

在免疫PCR中，一个中介分子同时具有与DNA、抗体分子特异结合的能力。其一端连接DNA（标记物），另一端连接抗原-抗体复合物，形成一个特殊的抗原-抗体-DNA连接物。作为标记物的DNA分子可用PCR扩增，若存在特异的PCR产物，则证明作为标记物的DNA分子已特异地与抗原-抗体复合物结合，而且表明了抗原的存在。可采用SAP（streptavidin-protein A）嵌合体作为中介物，它具有双特异性结合能力，一端为链霉亲和素，可结合生物素，另一端为可与IgG的Pc段结合的蛋白A。这样可特异地把生物素化的DNA分子和抗原-抗体复合物连接在一起。免疫PCR产物在普通的琼脂糖电泳上就可以检测出来，如将放射性同位素、荧光物或酶等掺入到PCR产物中，可进一步提高其灵敏度。

3.PCR-SSCP分析技术

由于单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。空间构象有差异的单DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。出此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以将构象上有差异的分子分离开，这种技术称为单链构象多态性（single-strand conformation polymorpHism, SSCP）分析。将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而出现了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。其基本过程：①PCR扩增DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。

若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，符合实际需要。

4.实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（realtime PCR）是对PCR产物进行实时检测分析的方法。PCR产物不需要电泳分析，具有快速、定量的优点。该方法必须使用PCR仪和荧光分光光度计一体化的定量PCR装置，即realtime PCR扩增仪。通常realtime PCR的实时检测是使用荧光物质来进行的。荧光检测方法有许多种，如TaqManTM探针法、嵌合荧光检测法、Molecular Beacon法。下面要介绍TaqManTM探针法。

（1）TaqMan技术的工作原理　TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的技术。在普通PCR扩增系统中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该方法过程：在所设计的寡核苷酸探针的5'端标记一个报告荧光基团（reporter R），靠近3'端标记淬灭荧光基团（quencher Q）。当探针保持完整时，报告基团反射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收，淬灭荧光基团抑制了报告荧光基团的荧光信号而不发光，该检测系统不能检测到报告荧光的信号。PCR反应前，探针与模板互补结合，PCR反应开始后，随着产物链的延伸。Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，PCR扩增时，淬灭荧光基团被具有5'→3'外切酶活性的TaqDNA聚合酶切掉，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭荧光基团的抑制作用消失而产生荧光，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号与PCR产物形成完全同步，通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进行定性和定量。荧光信号的强弱与PCR产物的数量成正比。

（2）定量步骤(www.chuimin.cn)

①确定CT值[C表示循环数（cycle），T表示荧光域值（threshold）]，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

②利用标准曲线对未知样品进行定量测定。获得未知样品的CT值后，从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小。值得注意的是，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线的方法。在荧光定量标准曲线图中，横坐标代表起始拷贝的对数，纵坐标代表CT值。TaqMan-PCR反应结果可用Sequence DetectorV分析。

③软件数据处理，拷贝数大于0者为阳性，否则为阴性。测量PCR产物的TaqMan探针是由一个短的脱氧寡核苷酸（20～25个碱基）组成，3'和5'两标记的荧光染料，分别用6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein, FAM）和6-羧基四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodamine, TAMRA）标记荧光报告基团和淬灭荧光基团，也叫作双记荧光寡核苷酸探针。

5.反转录PCR

反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）即反转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再从cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

6.不对称PCR

在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度[（50～100）：1]进行扩增，经若干循环后，低浓度的引物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，所以可得到单链PCR产物（ssDNA）。因为PCR反应中使用的两种引物浓度不同，所以称为不对称PCR（asymmetric PCR）。该法产生的单链DNA可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。不对称PCR有两种方法：

①PCR反应开始时即采用不同浓度的引物。

②进行二次PCR扩增，第一次PCR用等浓度的引物，以期获得较多的目的DNA片段，提高不对称PCR产率，以第一次扩增产物（含双链PCR片段），用单引物进行第二次PCR扩增产生单链DNA。

7.反向PCR

反向PCR（inverse PCR, IPCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物含有两引物外未知序列，从而对未知序列进行分析研究。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，所以又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3'端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

（二）PCR检测技术在食品检验中的应用

PCR技术已用于细菌、真菌、病毒和寄生虫的检测，如沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、链球菌、结核分枝杆菌、布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、军团菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒、禽流感病毒等，寄生虫如弓形虫、阿米巴疟原虫等。

PCR技术虽是一种快速、特异、灵敏、简便、高效的检测新技术，但其广泛应用仍受到多种因素限制，包括操作过程中样品间的交叉污染和极少量外源性DNA的污染，都会对检测结果产生很大影响，从各种食品原料中高效率抽提DNA的方法有待于开发，不能区别活菌和死菌，容易受到食品基质、培养基成分的干扰，残留食物成分会抑制PCR反应，引物的设计及PCR反应条件是影响特异性和敏感性的重要因素。因而，实验室操作的规范化在PCR技术中是极其重要的，随着研究的不断深入，PCR检测方法也会得以发展和改善，必将在食品安全检测中得到更多的应用。

PCR检测技术在食品生物技术中的应用及优势

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