发酵产物提取方法及其在食品生物技术中的应用

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：发酵液提取的目的是除去与目标产物性质有很大差异的杂质，这一步可以使产物浓缩，并明显的提高产品质量。被吸附的流体称为吸附质，多孔的固体物质称为吸附剂。采用膜分离技术对酶制剂进行精制、浓缩，可使产品的纯度较传统的方法提高4～5倍，酶回收提高2～3倍，高污染液产出量减少到原来的1/3～1/4。

发酵液提取的目的是除去与目标产物性质有很大差异的杂质，这一步可以使产物浓缩，并明显的提高产品质量。常用的分离技术有沉淀、吸附、膜分离和萃取。

（一）沉淀技术

沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程。沉淀分离是一种初级分离技术，也是另一种形式的目标产物的浓缩技术，广泛应用于实验室和工业规模的发酵产物的回收、浓缩和纯化，有时多步沉淀操作也可直接制备高纯度的目标产品。沉淀法具有成本低、设备简单、收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点。

根据所加入沉淀剂的不同，主要分为以下几类：盐析法、等电点法、有机溶剂沉淀法。

1.盐析法

盐析法原理是：在溶液中加入中性盐，利用盐离子与蛋白质分子表面带相反电荷的极性基团的相互吸引作用，中和蛋白质分子表面的电荷，降低蛋白质分子与水分子之间的相互作用，蛋白质分子表面的水化膜逐渐被破坏。当盐离子达到一定浓度时，蛋白质分子之间的排斥力降到很小，于是很容易相互聚集，形成沉淀颗粒，从溶液中析出。不同的蛋白质盐析时所需盐的浓度不同，因此，调节盐的浓度，可以使蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。

生产中最常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠等。其中硫酸铵的溶解度大，在2～3mol/L时可以防止蛋白酶和细菌的分解作用，使蛋白质稳定保存数年，是最常用的盐析剂。

2.有机溶剂沉淀法

有机溶剂沉淀的原理是：加入有机溶剂后，会降低溶液介电常数，使溶质分子间的静电引力增加，溶解度降低；同时引起蛋白质脱水而沉淀；另外，有机溶剂破坏蛋白质之间的化学键，导致空间结构发生某种变形，疏水基团暴露，蛋白质沉淀。

常用有机溶剂及其沉淀能力次序为：丙酮＞乙醇＞甲醇。但丙酮易挥发且价格高，工业上多采用乙醇。用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。

3.等电点沉淀法

等电点法沉淀的原理是：蛋白质在等电点时溶解度最低；利用不同蛋白质具有不同的等电点达到分离浓缩的目的。因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，等电点沉淀法单独使用较少，主要用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白；多数情况下与其他条件和方法联合使用，如降温法、盐析法、有机溶剂法等。几种酶和蛋白质等电点见表6-8。

表6-8　几种酶和蛋白质的等电点（PI）

（二）吸附技术

吸附是指流体（液体或气体）与固体多孔物质接触时，流体中的一种或多种组分传递到多孔物质的外表面和微孔内表面并附着的过程。被吸附的流体称为吸附质，多孔的固体物质称为吸附剂。吸附分离技术是利用适当的吸附剂，将生物样品中某些组分选择性吸附，再用适当的洗脱剂将被吸附的物质从吸附剂上解吸下来，从而达到浓缩和提纯的分离方法。

吸附的类型包括物理吸附、化学吸附和离子交换吸附。物理吸附是指吸附剂和吸附质之间通过分子间引力产生的吸附；化学吸附是指吸附剂和吸附质之间通过发生电子的转移产生化学键的吸附；离子交换吸附是指吸附剂（离子交换树脂）和吸附质之间依据电荷差异而通过库仑力产生的吸附。在吸附条件上，温度、pH、盐的浓度，以及吸附质的浓度与吸附剂的量均对吸附效果有影响，实际在生产中吸附条件的选择主要应靠实践来确定。

常见的吸附剂包括：①活性炭：常用于生物产物的脱色和除臭，还应用于糖、氨基酸、多肽及脂肪酸等的分离提取；②硅胶：常用于萜类、生物碱、酸性化合物、磷脂类、脂肪类和氨基酸类的吸附分离；③氧化铝：广泛应用在醇、酚、生物碱、染料、氨基酸、蛋白质以及维生素、抗生素等物质的分离；④大网格聚合物吸附剂：适合于在水中溶解度不大，而较容易溶于有机溶剂中的活性物质，如维生素B12、四环素、土霉素、红霉素等的提取。也可用作食品工业糖浆的脱色。除上述吸附剂外，还有白陶土（白土、陶土、高岭土）、磷酸钙凝胶、氢氧化铝凝胶、滑石粉、硅藻土、皂土等吸附剂。

（三）膜分离技术

膜分离技术是目前被国际上公认的最有发展潜力的高效分离技术之一，利用膜对混合物中各组分的选择通透性来分离、浓缩和纯化目标产物。膜分离过程在常温下进行，具有设备简单、操作方便、处理效率高和节省能量等优点，适用于热敏物料、无相变和无化学变化的分离过程，已成为一种新型的分离单元操作。

1.膜分离技术基本原理(www.chuimin.cn)

膜分离过程的原理是：以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差、温度差等）时，原料组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。目前已经工业化应用的膜分离过程有微滤（MF）、超滤（UF）、反渗透（RO）、透析（DS）、电渗析（ED）等。以下是几种常见的膜分离技术，基本特征见表6-9。

表6-9　常用膜分离技术的基本特征

2.膜分离过程的操作特性和影响因素

对膜分离过程的影响因素包括三个方面：一是引起过滤效率下降的因素，如渗透压、溶液黏度等；二是引起膜堵塞的因素，如生物质、胶体等大分子在膜表面形成污垢等；三是引起膜损坏的因素，如高温、高压、游离氧等对膜的损害。

3.膜分离技术应用示例

（1）酶制剂的浓缩　传统蒸发浓缩能耗高，热相变过程生物酶易褐变、失活，超滤则能很好地解决这些问题，目前已应用于淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶制剂的发酵生产中。采用膜分离技术对酶制剂进行精制、浓缩，可使产品的纯度较传统的方法提高4～5倍，酶回收提高2～3倍，高污染液产出量减少到原来的1/3～1/4。

（2）酱油和醋的超滤澄清　传统的澄清技术往往达不到国家规定的卫生标准，而且浊度高，存放过程中会有大量的沉淀产生。采用超滤技术处理酱油、醋，能除去其中的大分子物质和悬浮物，达到澄清的目的，同时保持风味不变，卫生标准也符合要求。

（3）啤酒澄清除　菌啤酒的膜微滤技术主要用于啤酒的除菌过滤。我国有许多厂家如钱江啤酒厂、青岛啤酒厂、北京燕京啤酒厂，引进了德国、日本的设备和滤膜，用于生产纯生啤酒，取得了极其显著的经济效益。

（4）乳制品加工　乳制品加工中引入膜分离技术，在国外已得到较普遍的应用，并不断地进行技术改进和扩大应用范围。如从干奶酪中回收乳清蛋白；将巴氏杀菌过程和膜分离相结合，生产浓缩的巴氏杀菌牛奶，采用反渗透技术可将全脂奶浓缩5倍，脱脂奶浓缩7倍。

（四）萃取分离技术

萃取技术是20世纪40年代兴起的一项化工分离技术，它是用一种溶剂将目标产物从另一种溶剂（如水）中提取出来，达到浓缩和提纯的目的。相比其他分离方法，萃取分离技术具有以下优势：比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好，传质快；比蒸馏法能耗低；生产能力大，周期短，便于连续操作，容易实现自动化等。

萃取分离技术在生物合成工业上是一种重要的提取和分离混合物的方法，广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、甾体激素等发酵产物的提取分离。近20年来研究溶剂萃取技术与其他技术相结合从而产生了一系列新的分离技术如超临界萃取、逆胶束萃取、液膜萃取等。以下主要介绍溶剂萃取和双水相萃取分离技术。

1.溶剂萃取

溶剂萃取法以分配定律为基础。在溶剂萃取中，被提取的溶液称为料液，其中欲提取的物质称为溶质，用以进行萃取的溶剂称为萃取剂。经接触分离后，大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液称为萃取液，而被萃取出溶质的料液称为萃余液。分配定律是指溶质在萃取剂和萃余液中的分配不同而达到分离溶质的作用。

萃取法提取物质效果的好坏，关键在于选择适宜的溶剂（萃取剂），萃取用的溶剂除对产物有较大的溶解度外，还应有良好的选择性及萃取能力高，分离程度高。在操作使用方面还要求：①溶剂与被萃取的液相互溶解度要小，黏度低，界面张力适中，使相的分散和两相分离有利；②溶剂的回收再生容易，化学稳定性好；③溶剂价廉易得；④溶剂的安全性好。在生化工程中常用的溶剂有乙酸乙酯、乙酸丁酯和丁醇等。

影响萃取操作的主要因素有pH、温度、盐析、带溶剂等。①在萃取操作中正确选择pH很重要，一方面pH影响分配系数，因而对萃取收率影响很大；另一方面pH对选择性也有影响。②温度对产物的萃取有很大的影响，一般生化产品在温度较高时都不稳定，故萃取应维持在室温或较低温度下进行。但在个别场合，如低温对萃取速度影响较大，此时为提高萃取速度可适当升高温度。此外温度也会影响分配系数。③加入盐析剂如硫酸铵、氯化钠等可使产物在水中的溶解度降低，而易于转入溶剂中去，也能减少有机溶剂在水中的溶解度。盐析剂的用量要适当，用量过多会使杂质一起转入溶剂，当盐析剂用量大时，应考虑回收和再利用。④有的产物水溶性很强，通常在有机溶剂中的溶解度都很小，如要采用溶剂萃取法来提取，可借助于带溶剂，即使是水溶性不强的产物，有时为提高其收率和选择性，也可考虑采用带溶剂。所谓带溶剂是指能和欲提取的生物物质形成复合物，而易溶于溶剂中的一种产物，且此复合物在一定条件下又要容易分解。

2.双水相萃取

影响萃取操作的因素除上述外，生产上还常会发生乳化。乳化是一种液体分散在另一种不相互溶的另一种液体中的现象。乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带即发酵液废液中夹带有机溶剂微滴，溶剂相中夹带发酵液微滴。产生的乳化有时即使采用离心分离机也往往不能将两相分离完全。所以必须破坏乳化。

当将有机溶剂（通常为油）和水混在一起搅拌时，可能产生两种形式的乳化液，一种是以油滴分散在水中，称为水包油型或O/W型乳浊液；另一种是水以水滴形式分散在油中，称为油包水型或W/O型乳油液。众所周知，油和水是不相溶的，两者混在一起，会很快分层，并不能形成乳浊液。一般要有第三种物质——表面活性物质存在时，才容易发生乳化，这种物质称乳化剂。表面活性物质是一类分子中一端具有亲水基团[（如—COONa，—SO3Na，—OSO3Na、—N（CH3）3Cl、—O（CH2CH2O）nH等）]，另一端具有亲油基团（烃链）且能降低界面张力的物质。这种物质具有亲水、亲油的两性性质，所以能够把本来不相溶的油和水连在一起，且其分子处在任一相中都不稳定，而当处在两相界面上，亲水基伸向水，亲油基伸向油时就比较稳定。破坏乳化液的方法有过滤和离心分离、加热、加电解质、吸附法、顶潜法和转型法及添加去乳化剂。在生物合成工业上使用的去乳化剂有两种，一种是阳离子表面活性剂溴代十五烷基吡啶，另一种是阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠。

发酵产物提取方法及其在食品生物技术中的应用

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